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文献解读：一种由CRISPRCas9介导的基因编辑方法

mayitao /发布时间:1517898660 /浏览量:22

题目：AgenericstrategyforCRISPR-Cas9-mediatedgenetagging
期刊：NatureCommunation
影响因子：12.124
主要技术：CRISPR-Cas9
研究背景
CRISPR-Cas9技术虽然使基因敲除变得简便，但标签插入依然由于每插入一个位点都需要针对该位点构建donor质粒且依赖自发的同源重组而显得昂贵且存在一定难度。本研究发现了一种能解决上述问题的基因标签插入方法，该方法只需构建一个donor质粒即可用于所有位点的精准的标签插入且不依赖于同源重组。
研究内容及结果
1.本研究首先构建了能表达斑马鱼tia1l基因sgRNA的donor质粒，该质粒在Cas9蛋白的存在下能释放杀稻瘟菌素CDS，与携带Cas9蛋白和特定位点sgRNA的质粒共转入大多数基因都只有1个拷贝的HAP1细胞中，初步评估了杀稻瘟菌素CDS插入的效率，6个基因12个位点中有11个成功插入了杀稻瘟菌素CDS。

2.对上述筛选到的成功插入杀稻瘟菌素CDS的细胞进行克隆分离并检测发现，12个单克隆中有11个是在PAM位点前3个碱基处精确插入杀稻瘟菌素CDS。

3.qPCR检测野生HAP1细胞中分别用IFNβ、ActivinA、FGF1诱导0、4、8、24h后，IFIT1、DACT1、EGR1的表达了均上调。将NanoLuc报告基因分别插入IFIT1、DACT1、EGR1，加入诱导剂后IFIT1、DACT1、EGR1的表达量均上调。NanoGlo荧光素酶检测结果与qPCR结果一致，表明本研究中使用的标签插入方法能用来监控内源基因的表达。

4.运用上述的标签插入方法在HAP1细胞内源基因LMNA、TERF1、LAMP1中插入荧光标记基因TurboGFP并用流式细胞术富集成功插入标签的细胞，以用于活细胞成像研究，可以对目标基因表达产物进行精准定位。

文章小结
运用本研究中的标签插入方法，可以对目标细胞系靶基因定点插入NanoLuc、TurboGFP或其他标签，实现对靶基因表达量的监控或进行亚细胞定位。该方法比传统的依赖于同源重组双交换的标签插入方法更加省时，操作上更为便捷，且一个donor载体可以用于不同基因不同细胞的同一种标签插入，节约成本。
解析文献
DanielH.Lackner,AlexiaCarre´,etal.AgenericstrategyforCRISPR-Cas9-mediatedgenetagging[J].NatureCommunications,2015,6:10237.
参考文献
1.Auer,T.O.,Duroure,K.,DeCian,A.,Concordet,J.P.&DelBene,F.HighlyefficientCRISPR/Cas9-mediatedknock-ininzebrafishbyhomologyindependentDNArepair.GenomeRes.24,142–153(2014).
2.Maresca,M.,Lin,V.G.,Guo,N.&Yang,Y.Obligateligation-gatedrecombination(ObLiGaRe):custom-designednuclease-mediatedtargetedintegrationthroughnonhomologousendjoining.GenomeRes.23,539–546(2013).
3.Cristea,S.etal.Invivocleavageoftransgenedonorspromotesnucleasemediatedtargetedintegration.Biotechnol.Bioeng.110,871–880(2013).
4.Ran,F.A.etal.InvivogenomeeditingusingStaphylococcusaureusCas9.Nature520,186–191(2015).
5.Cong,L.etal.MultiplexgenomeengineeringusingCRISPR/Cassystems.Science339,819–823(2013).

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