按照nature的标准，一个严格的RNAi介导knockdown实验要有6个对照：

A.转染试剂对照（监控转染及培养条件对结果的影响）；

转染试剂对照可以检测转染试剂对细胞的毒性、细胞的成活率等细胞转染的各个因素影响。严格的RNAi介导knockdown实验对照；

B.positivesiRNA对照（StandardPositiveControlReagents）

•实验验证可稳定地沉默高表达的人、小鼠和大鼠的持家基因。

•利用阳性对照来确认RNAi实验中转染、RNA提取和基因表达检测方法是可靠的。

C.阴性对照

C1.nonsensesiRNA对照（StandardNegtiveControlReagents）

•特殊设计的单条或者混合的siRNA试剂，不靶向任何已知的人、小鼠和大鼠基因。

•无靶点siRNA通过基因芯片检测证明最小脱靶效应。

•化学修饰确保不和RISC结合。

C2.ScrambledsiRNAs(CustomizedNegativeControlsiRNAs)

C3.荧光标记（6-FAM）通用阴性对照。

 1．RNAinegativecontrol与哺乳动物基因无同源性

 2．通过标记荧光，可以方便地在荧光显微镜下观察转染情况；

 3．可用于优化转染条件和评价转染效率；

 4．具备很好的pH耐受性，在活细胞中更稳定。

D.Off-target对照（技术重复对照）

Off-targeteffects（脱靶效应）最早由Dharmacon科学家Jackson和他的同事们提出（Fedorov,Y.,etal."Off-targetingBysiRNACanInduceToxicPhenotype."RNAAccepted(2006).）他们给细胞转染特定基因的单条siRNA后运用全基因组芯片检测技术鉴定表达上调/下调1.5到3倍的靶基因数量。研究人员发现在这种情况下有大量的基因被非特异性的调控着。siRNA正义链和反义链与脱靶基因的互补水平有高有低，并且每条siRNA所引发的脱靶基因表达谱也不尽相同，反映了序列依靠性的脱靶效应。

Off-target效应就是指干扰shRNA序列进入了microRNA途径，通过microRNA途径，其可以不受完全互补的限制而调控大量靶基因的表达。原本需要19~23nt的RNA序列完全互补才能发生干扰作用，而如果进入microRNA途径，只需要11~15nt互补就可以产生干扰效果，这使得siRNA可能与非靶基因结合而导致非靶基因沉默，造成脱靶。

如果脱靶干扰的部分基因，正好与目的基因位于同一信号通路中，或者与目的基因的生物学功能相似，那么，如果因脱靶而干扰了其它基因，亦会造成和目的基因受到干扰后相同的细胞表型改变。而实际上，可能选择的这条shRNA序列并没有对目的基因造成有效干扰，或者虽然干扰了目的基因，但是并不会引起预期的细胞表型改变。

基于以上原因，需要有相应的对照来说明Off-target效应，即需要有相关对照或者实验来说明，所获得的实验结果，不是由于Off-target效应而产生。这就需要利用至少2个靶点的siRNA同时实验，2个siRNA互为off-targetcontrol，当两者的表型相同时，才有可能是特异性的knockdown效应。

E.rescue对照（knockdown之后做超表达，看是否有性状的逆转，也是为了说明knockdown的特异性，即所谓的“RNA干扰回复实验“）；

F.全表达组扫描对照（就是转录/表达芯片扫描，以最终确定表型不是由于off-target造成）。

实际实验中，全表达组扫描对照很少有文献涉及。其它几个对照中，A,C两种对照即所谓的空白细胞对照、NC对照；D,E两种对照，主要是为了解决off-target效应，选做一种即可，一般建议选E。