2021-09-14【原创】CRISPR/Cas9制作基因敲除和基因敲入大小鼠的一些经验分享

大家都知道Cas9很火，用于Genomeediting非常方便。本文主要是回顾一下发现历程、分享一些在制作基因敲除细胞系、基因敲除小鼠和最近做GenomewideCas9筛选过程中的一些心得体会。
一、Cas9简介
二、如何设计gRNA
三、如何快速克隆gRNA
四、如何制作基因敲除、基因敲入和条件性敲除
A
B
C条件性敲除
目前的条件性敲除小鼠主要是基于Cre-LoxP系统的。Cre-LoxP系统是源于P1噬菌体的一个DNA重组体系,由Cre酶和相应的LoxP位点组成,它能导致重组发生在特定的DNA序列处(LoxP位点),该系统可以将外源基因定点整合到染色体上或将特定DNA片段删除。


传统的条件性敲除
基于Cre-LoxP的基因打靶要分两步来进行。
传统方法，首先要在胚胎干细胞的基因组中引入LoxP序列，这一步可以通过打靶载体的设计和对同源重组子的筛选来实现。
第二步，通过Cre介导的重组来实现靶基因的遗传修饰或改变。在细胞水平上，可以用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞，通过识别LoxP位点将抗性标记基因切除；在个体水平上将重组杂合子小鼠与Cre转基因小鼠杂交，筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。将Cre基因置于可诱导的启动子控制下，通过诱导表达Cre重组酶而将LoxP位点之间的基因切除（诱导性基因敲除），实现特定基因在特定时间或者组织中的失活。
一般需要一年以上的时间，价格在15-20万不等。
基于Cas9系统的条件性敲除
原理上和传统的条件性敲除类似，差别在于利用OptimizedCas9/CRISPRSystem(OCAS)技术在基因组上加入loxp序列，可以快速获得Loxp位点插入的小鼠。
一般只需要4-5个月。价格也比传统方法大大降低。
五、如何制作基因敲除小鼠
因为技术和仪器的缺陷，一般实验室都不太会做到这一步。
mark先定格框架慢慢写
还开了另外一个帖子讲Cas9技术本身及在细胞生物学上的应用。也欢迎交流。
Cas9基因敲除技术详述-蚂蚁淘论坛