10×扩增缓冲液　 10ul

 

4种dNTP混合物　各200umol/L

 

引物　　　　　  各10～100pmol

 

模板DNA　　　　0.1～2ug

 

TaqDNA聚合酶　 2.5u

 

Mg²⁺　　　　　　1.5mmol/L

 

加双或三蒸水至　 100ul

 

二、PCR引物设计 

PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

1. 引物设计的基本原则

（1） 引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。

（2） 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

（3） 引物内部不应出现互补序列。

 

（4）两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3′端的互补重叠。

 

（5） 引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。

 

（6）引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。

（7） 引物的5′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

2. 引物设计软件

PrimerPremier5.0（自动搜索）*、Oligo6（引物评价）、VectorNTISuit、DNAsis、Omiga、DNAstar、Primer3（在线服务）。

三、模板的制备 

（1）PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。

（2）模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。

（3）标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。

四、PCR反应条件的控制 

1. PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子。 

2. 镁离子浓度总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5mmol/L。

　　
3. 底物浓度dNTP以等摩尔浓度配制，20～200umol/L。

　
4. TaqDNA聚合酶2.5U(100ul）。

　　
5. 引物浓度一般为0.1～0.5umol/L。

　
6. 反应温度

（1）变性温度和时间95℃，30s。

（2）退火温度和时间低于引物Tm值5℃左右，一般在45～55℃。

（3）延伸温度和时间72℃，1min/kb(10kb内）。

（4）Tm值=4(G+C)+2(A+T)

7. 循环次数：一般为25～30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。

五、PCR的循环参数 
 
1. 预变性（Initialdenaturation）

模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。

2. 循环中的变性步骤

循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可缩短该步骤时间，变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。

3. 引物退火（Primerannealing）

退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。

退火温度对PCR的特异性有较大影响。

4. 引物延伸

引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略

延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。

5. 循环数

大多数PCR含25-40循环，过多易产生非特异扩增。

6. 最后延伸

在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。

六、PCR步骤 
 
1. DNA变性

（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。

2. 退火

（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

3. 延伸

（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。

七、PCR检测 
 
PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素（溴化乙锭，EB）染色凝胶电泳是最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法。近年来以荧光探针为代表的检测方法，有逐渐取代电泳法的趋势。