杆状病毒（Baculovirus）表达系统重组蛋白表达与纯化相关交流-蚂蚁淘在线

提供商：	生工生物工程
服务名称：	杆状病毒（Baculovirus）表达系统重组蛋白表达与纯化

步骤1.目标基因全基因合成：

1.从基因库中搜索目标蛋白的cDNA序列。

2.根据选用的表达系统对cDNA进行密码子，mRNA二级结构等的优化。

3.合成设计好的基因序列。

交付内容：目的基因（在T载体或常规穿梭载体上）及测序报告。

时间：2-3周

步骤2.目标基因亚克隆到pFastBac供体质粒：

1.扩增并抽提含有目标基因的载体质粒。

2.将目标基因亚克隆到pFastBac供体载体上。

3.测序验证构建质粒的准确性。

4.通过中抽获得重组的质粒DNA

交付内容：正确构建的重组表达质粒，含重组质粒的DH5α菌株及测序报告。

时间：2-3周

步骤3.制备重组杆状病毒BacmidDNA：

1.将重组的pFastBac供体质粒转化到大肠杆菌DH10Bac感受态菌株中。

2.通过抗生素平板筛选出含有重组Bacmid的菌株。

3.抽提质粒获得重组的杆状病毒BacmidDNA。

交付内容：重组杆状病毒BacmidDNA，含重组质粒的DH10Bac菌株

时间：2周

步骤4.转染昆虫细胞Sf-9：

1.利用转染试剂将重组Bacmid质粒转入昆虫细胞Sf-9。

2.收集成熟的重组杆状病毒并检测病毒的滴度。

3.通过多次感染提高病毒的滴度，并扩增病毒数量。

4.通过SDS-PAGE和Western-blot检测目标蛋白表达情况。

交付内容：高滴度重组杆状病毒，病毒滴度及蛋白表达检测结果（如果转染不成功，则不收取费用。如果没有检测到目标蛋白表达，则只收取50%实验费用）。

时间：3周

步骤5.目标蛋白表达及纯化：

1.培养500ml昆虫细胞至对数期，然后加入适量病毒感染细胞并表达目标蛋白。

2.收集含有目标蛋白的部分（细胞或培养上清）。

3.通过亲和，离子交换，疏水及凝胶过滤等多种层析方法纯化表达的重组蛋白。

4.通过SDS-PAGE电泳检测每步结果并控制最终产品质量。

5.通过Western-blot验证目标蛋白正确性。

6.可提供表达细胞株：Sf-9，Sf-9Mimic，HighFive。

交付内容：纯化好的目标蛋白0.1~2mg及纯化报告。可按客户要求提供含纯化标签（Tag）或切除纯化标签（Tag）的最终蛋白，纯度最高可达90%以上。

时间：2-3周

说明：
1.如果没有获得目标蛋白，则不收取任何费用。如果最终得到的产品未达到合同要求而客户又同意接受该产品，则双方协商本步骤费用。

2.如果客户需要详细的纯化工艺，包括详细纯化条件及每步结果，则需要加收100%相应费用。

3.因为每个重组蛋白的表达量及纯化得率都不相同，我们最终根据实际情况将给客户提供最少0.1mg，最多2mg的目标蛋白，所收取的费用是相同的。

4.我们提供的最终产品一般为保存于常规的缓冲液（Tris-HCl，PBS或乙酸-乙酸钠缓冲液）中蛋白质溶液，并且其中不含有尿素或盐酸胍等变性剂。但因为我们无法为每个定制的蛋白建立活性检测系统，所以我们无法保证最终产品的生物学活性，不过我们承诺将会按照最大可能保护其活性的方法来制备目标蛋白。如果客户一定要求目标蛋白活性，我们可以先提供约50μg纯化后样品供客户检测活性。若样品活性不合格，我们不再提供目标蛋白给客户并只收取本步骤费用的30%，而如果样品活性合格，我们将提供合同要求的相同质量的目标蛋白给客户并需要加收本步骤费用的100%。

5.每次Western-blot检测最多7个样品，因为要加入阳性对照，阴性对照以及Marker。本步骤只包含一次免费检测，如果需要更多次检测则需另收费。我们可以免费为客户提供抗His-tag的一抗，如果客户需要使用其他一抗，则需要客户提供。另外由于Western-blot检测结果受很多客观因素影响，因此我们并不能确保检测结果（可能会出现假阳性或是假阴性的结果）。如果结果不正常，我们可以免费重做一次。

步骤6.目标蛋白的再加工及详细检测：

1内毒素去除，除菌，冻干等进一步加工。

2通过HPLC，质谱等方法详细检测目标蛋白的质量。

服务内容：
1：除内毒素，

2：过滤除菌，

3：冻干，

4：HPLC检测，

5：质谱检测，

6：N端测序。

交付内容：加工后的终产品及相关实验和检测报告。

时间：2-3周

步骤7.大规模制备：

按照小试工艺放大生产规模，制备客户需要的合格蛋白产品。

交付内容：合格的目标蛋白及服务报告。

时间：协商

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