一、材料

1.缓冲液和溶液

CsCl(固体）（用于三级不连续梯度的CsCl液层），溴化乙锭（10mg/ml)，TE(pH8.0)。



2.核酸和寡核苷酸

粗制质粒样品

每个梯度的DNA用量宜来自不超过50ml过夜培养物的粗制质粒。来自100ml培养物的粗制质粒样品则应重溶于约0.9mlTE（pH8.0）中，从而在两个不连续梯度之间足以形成一个中间层。

3.专用设备

皮下注射针头（21号），折光仪（可选），带有18号骨髓针头（10cm）的注射器（3ml、5ml和5~10ml），带有18号骨髓针头（10cm）的结核菌素注射器（1ml）。

4.离心机和转子

超速离心转子和离心管

带有5ml或10mlpolyallomer超速离心管的Beckman型70.1Ti或Sovall型65.13转子（BeckmanQuich-Seal或相当产品）。

二、方法

1.用一个带有18号骨髓针头（10cm)的3ml皮下注射器，转移1.5ml顶层CsCl溶液(35%)至一个5mlpolyallomer超速离心管（BeckmanQuich-Seal或相当产品）中。

2.用一个带有18号骨髄针头（10cm)的1ml结核菌素注射器，将0.5ml含有质粒DNA的中层CsCI溶液（44%)铺于顶层液下方的离心管底部。

3.用一个带有18号骨髓针头（10cm)的5ml皮下注射器，将底层CsCl溶液（59%)铺于中层CsCl溶液下方、充满离心管。

4.将该密封的离心管以330000g(60000r/min,Beckman型70.1Ti转子）离心5h。离心时确保转子中离心管重量的平衡。按照厂家说明密封离心管。

使用更高速的离心机和转子能够进一步减少离心时间。例如，使用BeckmanXl-90的Vti90转子，只需离心20min。

5.收集闭环DNA区带：

(1)用21号皮下注射针头在离心管顶端扎一个小孔以使液体被吸出时空气能进入。

(2)用乙醇小心擦拭离心管外壁以除去任何油脂，然后用一块Scotch胶带或Time胶带贴于管外壁。

胶带起密封作用以减少针头穿刺后的泄漏。

(3)将一个5~10ml的一次性注射器装上一个无菌的18号皮下注射针头，将针头斜面向上地穿过胶带插入管中，以使针头的斜面开口正好位于较低的DNA区带(闭环质粒DNA)的下方。

(4)缓慢吸出质粒DNA，小心不要搅动上方黏稠的染色体DNA区带。

欲避免染色体DNA的污染，不要试图从梯带中移去毎一点可见的痕量闭环质粒DNA。

有些研究者喜欢在移去较低的闭环质粒DNA区带之前先去除较上方的DNA区带。此法不太可取，这是因为位于较上层的黏稠的高分子质量染色体DNA能缠绕住闭环质粒DNA并将其带出离心管。



6.从DNA中去除溴化乙锭。