2009-03-23【交流】大家来谈一谈抗体吧，一抗，二抗，荧光抗体[精华]

欢迎有经验的战友前来讨论，加分从优哦..........有关一抗方面的讨论已经有不少，但系统讨论一抗，二抗，荧光抗体等还少有。我来谈谈自己的实验体会：1、一抗质量是酶免疫组化、免疫荧光和Western blotting等试验中的最关键因素之一。从免疫组化选择抗体来说，质量最好的公司可能是Chemicon、upstate、Abcam、Dako公司等；从Western blotting选择抗体来说，信价比最好的可能是Santa Cruz公司，一般都1ml，价格在2000元每株左右。而一抗订购中选择原则有1）选择单克隆还是多克隆抗体，前者特异性好，而后者灵敏度高；2）选择何种种属来源？一般兔来源的多是多克隆；而小鼠来源的多是单克隆，但也有另外。这也决定了你的二抗类型。3）检测何种种属的抗原，即species reactivity:Hu-human, Ms-mouse, Rat, Goat, Rb-rabbit, Shp-sheep等；这个很重要。4）抗体类型：IgG1/IgG2a/IgM?一旦一抗选为IgM，那么你二抗就必须是抗IgM；5)应用范围：WB, IP, IF, IHC(P), ELISA?一抗说明书中注明抗体可以应用于western blotting、免疫沉淀、免疫荧光、免疫组化（石蜡切片）、ELISA等等，这根据你实验目的抉择。6）抗体公司的选择，主要根据信价比的高低以及高质量文献数据支持。2、二抗选择：一般有生物素标记、HRP标记和荧光素标记的二抗等多种。一抗种属选择好后，那么二抗只能是某种抗一抗种属来源的抗体，如果是酶免疫组化，则可以选择Bio-或HRP-标记，可以买不同公司单独的抗体，也可购买二抗染色试剂盒，包括二抗、SP等；而免疫荧光则可以选择荧光素标记的二抗，可以买美国Jackson Research公司等荧光素二抗，质量还不错。最后，建议大家可能还是在排除方法、切片中抗原有无等前提下来客观、正确评价各种抗体的质量。以上个人观点，供大家学习讨论。

自己买过不少公司的抗体，我的实验主要就是western还有，流式，confocal等，用过的抗体有CST,santacruz,abcam,sigma及中山金桥的分装抗体，二抗不管是HRP,还是Fitc，还是罗丹明都买的中山金桥公司的，另外，国产的，我买过普利来的FLAG标签单抗。以上不同公司的一、二抗，我谈谈个人感觉：1，国外的公司，首先ABCAM，sigma的抗体，相当不错，几乎没有背景，效价相当高，sigma有小包装，几百块就可以的；其次，CST公司在信号通路方面的抗体很好，如AKT、AMPK,P38、JNK等，最近该公司推出上下游套装，很实惠的；最后，santacruz的抗体，我买过几个，还行，但是，本室人员买过其他的，有些就是做不出来，该公司投诉应该是最多的，买santa就像做公交车啊！2，国内抗体：普利来标签抗体相当不错的，中山金桥分装santa的经常做不出来（也有还行的，但是不多，靠运气吧），做出来的背景也深，只缘身在此山中啊！我室买过p53几个分装抗体，居然能爆出六七条条带，然而，借的他室的santa的原装p53，条带就很单一，据说，中山金桥分装的时候稀释了santa的原装抗体，可见，分装的不太好。3，二抗：中山金桥，不管是HRP，还是荧光的，还不错的，估计，别家国产的，也不错。

我个人觉得免疫组织化学染色除了与所选抗体的质量有很重要关系之外，有时与动物的种属也有一定关系。尤其是mouse来源的一些一抗在检测mousetissue时会出现很高的非特异染色现象。原因不太清楚。另外即便是冰冻切片在进行免疫组化和荧光检测时有些抗原的检测也需要进行抗原修复，尤其是核抗原。通常用50%的formamide和50%的2XSSC，65度1h。有的抗原修复如Abeta则需要formicacid来处理。除此之外有时候最让人不起眼的PBS的PH值和tritonx-100的浓度都会对实验有影响。血清封闭的浓度和时间也可以调节背景的强度。对待那些非特异染色强的抗体可以考虑增加血清封闭的浓度和时间；而对于staining很弱的抗体，也可考虑降低血清封闭的浓度和时间，在还是不行的情况下还需考虑增加一抗或者二抗的浓度或孵育时间。当然还有很多很多可能的因素会影响到免疫组化的结果。在实践过程中不断地去学会发现问题和解决问题，这其实也是一种自我价值的体现。这是咱第一次发帖，希望版主加分，让咱脱贫啊！版主wanliheng留言:久等了！以前没有看到！不过遇到这样的情况自己及也要及时申诉啊！那是你的权利！

欢迎有经验的战友前来讨论，加分从优哦..........有关一抗方面的讨论已经有不少，但系统讨论一抗，二抗，荧光抗体等还少有。我来谈谈自己的实验体会：1、一抗质量是酶免疫组化、免疫荧光和Westernblotting等试验中的最关键因素之一。从免疫组化选择抗体来说，质量最好的公司可能是Chemicon、upstate、Abcam、Dako公司等；从Westernblotting选择抗体来说，信价比最好的可能是SantaCruz公司，一般都1ml，价格在2000元每株左右。而一抗订购中选择原则有1）选择单克隆还是多克隆抗体，前者特异性好，而后者灵敏度高；2）选择何种种属来源？一般兔来源的多是多克隆；而小鼠来源的多是单克隆，但也有另外。这也决定了你的二抗类型。3）检测何种种属的抗原，即speciesreactivity:Hu-human,Ms-mouse,Rat,Goat,Rb-rabbit,Shp-sheep等；这个很重要。4）抗体类型：IgG1/IgG2a/IgM?一旦一抗选为IgM，那么你二抗就必须是抗IgM；5)应用范围：WB,IP,IF,IHC(P),ELISA?一抗说明书中注明抗体可以应用于westernblotting、免疫沉淀、免疫荧光、免疫组化（石蜡切片）、ELISA等等，这根据你实验目的抉择。6）抗体公司的选择，主要根据信价比的高低以及高质量文献数据支持。2、二抗选择：一般有生物素标记、HRP标记和荧光素标记的二抗等多种。一抗种属选择好后，那么二抗只能是某种抗一抗种属来源的抗体，如果是酶免疫组化，则可以选择Bio-或HRP-标记，可以买不同公司单独的抗体，也可购买二抗染色试剂盒，包括二抗、SP等；而免疫荧光则可以选择荧光素标记的二抗，可以买美国JacksonResearch公司等荧光素二抗，质量还不错。最后，建议大家可能还是在排除方法、切片中抗原有无等前提下来客观、正确评价各种抗体的质量。以上个人观点，供大家学习讨论。

人用单克隆抗体质量控制技术：http://tieba.baidu.com/f?kz=368894283

santacruz的抗体都比较好用,我们常买国内中杉金桥代理的产品.不过荧光2抗稍微提一下,他们的CY3经常染的是漫山遍野一片红......至今不清楚具体原因.常见的几种荧光2抗,FITC,罗丹明的结果都是比较不错的.以前经常听别人说博士德的抗体差,但是说实话我也用过几种,结果其实也还可以,和抗体关系不大.组化的过程很简单,主要在于每一步的细心,几乎没有做不出来的组化,只有结果的好看与否,组化图片其实也是种艺术.

santacruz的biotin标记的二扛我们用很多还不错，但是荧光二扛做双标基本没成过（奇怪啊）最后只好换成Invitrogen的博士德的抗体大多数需要做修复，我对他们公司做过售后咨询，态度还算不错，有专门的QQ，有问题可以加了问，但是客观的说他们的抗体测试并不严谨，比方说我买了一个兔抗人，大鼠，小鼠3个种属的细胞因子的抗体，后来我问公司，公司说事实上只做了人的组化和小鼠的westernblot（大概是这样吧，记不清了），反正是没有都做完全，就是理论上3个种属都可以出来。价格上算算下来也比国外的贵，看着便宜其实还是因为量少。所以大家有钱还是建议买进口抗体

用过不少公司的二抗，包括santa,Promega,Invitrogen,abcam,等等。这里着重提出，invitrogen的荧光二抗一般都是Alexa标记的，另外他们的ProlongGold抗粹灭剂使我用过的最好的。它自身就能形成凝胶，不需要额外的固定。Alexa和ProlongGold配合使用的时候，抗荧光粹灭非常有效。我们的共聚焦显微镜扫描2048像素的三维图，使用别的抗粹灭剂很容易就形成“黑洞”，不过prolonggold处理过的片子，几乎看不到信号的损失。另外，我们做荧光双标、三标的时候，效果一直很好。Alexa和ProlongGold在欧洲这边的口碑都不错。

这2天做实验用的是一个师姐买的三抗荧光抗体据说已经买了3年多了=.=，sigma的提高了下稀释度到1：200效果仍然很好啊

免疫组化用的一抗可以标记biotin吗？如果可以，怎么才能消除内源性的biotin？

自己买过不少公司的抗体，我的实验主要就是western还有，流式，confocal等，用过的抗体有CST,santacruz,abcam,sigma及中山金桥的分装抗体，二抗不管是HRP,还是Fitc，还是罗丹明都买的中山金桥公司的，另外，国产的，我买过普利来的FLAG标签单抗。以上不同公司的一、二抗，我谈谈个人感觉：1，国外的公司，首先ABCAM，sigma的抗体，相当不错，几乎没有背景，效价相当高，sigma有小包装，几百块就可以的；其次，CST公司在信号通路方面的抗体很好，如AKT、AMPK,P38、JNK等，最近该公司推出上下游套装，很实惠的；最后，santacruz的抗体，我买过几个，还行，但是，本室人员买过其他的，有些就是做不出来，该公司投诉应该是最多的，买santa就像做公交车啊！2，国内抗体：普利来标签抗体相当不错的，中山金桥分装santa的经常做不出来（也有还行的，但是不多，靠运气吧），做出来的背景也深，只缘身在此山中啊！我室买过p53几个分装抗体，居然能爆出六七条条带，然而，借的他室的santa的原装p53，条带就很单一，据说，中山金桥分装的时候稀释了santa的原装抗体，可见，分装的不太好。3，二抗：中山金桥，不管是HRP，还是荧光的，还不错的，估计，别家国产的，也不错。

本人及本研究所使用抗体的情况..觉得DAKo的抗体做免疫组化效果最好，但是种类很少，其次abcam的也不错，用了几种都染出来了.

选择贵的，你就选择了对的！

我现在用的是R&D的一抗，Abcam的二抗，做的挺好。并且售后服务也不错

抗体类型怎么确定啊？？？非常低能的问题，希望给与指点

cyxgj抗体类型怎么确定啊？？？非常低能的问题，希望给与指点举例子：假如你要做兔子的心肌细胞中的肌钙蛋白的检测；那么你就买A抗兔的抗体，然后二抗买B抗A的抗体就可以。

sigma的抗体确实不错。放了好几年，效果都非常好。santa的确实不好，得靠运气。荧光抗体用碧云天的，感觉还行。刚刚订了DAPI，以前没做过，只是听别人说国产的也行，就买了碧云天的。后来上网查，才知道sigma的那么便宜，早知道就买sigma的了。

展开引用7公主sigma的抗体确实不错。放了好几年，效果都非常好。santa的确实不好，得靠运气。荧光抗体用碧云天的，感觉还行。刚刚订了DAPI，以前没做过，只是听别人说国产的也行，就买了碧云天的。后来上网查，才知道sigma的那么便宜，早知道就买sigma的了。......碧云天的dapi我个人觉得挺好的，嘿嘿

我个人觉得免疫组织化学染色除了与所选抗体的质量有很重要关系之外，有时与动物的种属也有一定关系。尤其是mouse来源的一些一抗在检测mousetissue时会出现很高的非特异染色现象。原因不太清楚。另外即便是冰冻切片在进行免疫组化和荧光检测时有些抗原的检测也需要进行抗原修复，尤其是核抗原。通常用50%的formamide和50%的2XSSC，65度1h。有的抗原修复如Abeta则需要formicacid来处理。除此之外有时候最让人不起眼的PBS的PH值和tritonx-100的浓度都会对实验有影响。血清封闭的浓度和时间也可以调节背景的强度。对待那些非特异染色强的抗体可以考虑增加血清封闭的浓度和时间；而对于staining很弱的抗体，也可考虑降低血清封闭的浓度和时间，在还是不行的情况下还需考虑增加一抗或者二抗的浓度或孵育时间。当然还有很多很多可能的因素会影响到免疫组化的结果。在实践过程中不断地去学会发现问题和解决问题，这其实也是一种自我价值的体现。这是咱第一次发帖，希望版主加分，让咱脱贫啊！版主wanliheng留言:久等了！以前没有看到！不过遇到这样的情况自己及也要及时申诉啊！那是你的权利！

碧云天的DAPI染色液好用吗？

cl5823283碧云天的DAPI染色液好用吗？强烈推荐，如果只是用来复染细胞核的话，其他用途尚未接触。直接买工作液就行。碧云天不会告诉你他的工作液的配方及dapi浓度，我问了，他们说是机密。建议买回来以后，先放4度融化，然后分装-20度保存。用的时候取1管放4度即可。（我一般是1ml每管分装的。）

展开引用wwwdbwww用过不少公司的二抗，包括santa,Promega,Invitrogen,abcam,等等。这里着重提出，invitrogen的荧光二抗一般都是Alexa标记的，另外他们的ProlongGold抗粹灭剂使我用过的最好的。它自身就能形成凝胶，不需要额外的固定。Alexa和ProlongGold配合使用的时候，抗荧光粹灭非常有效。我们的共聚焦显微镜扫描2048像素的三维图，使用别的抗粹灭剂很容易就形成“黑洞”，不过prolonggold处理过的片子，几乎看不到信号的损失。另外，我们做荧光双标、三标的时候，效果一直很好。Alexa和ProlongGold在欧洲这边的口碑都不错。......请问您指的黑洞是什么情况，细胞变成黑洞吗？

capchaline请问您指的黑洞是什么情况，细胞变成黑洞吗？我猜是局部荧光淬灭，二周围又没有淬灭，形成的。

wanliheng我猜是局部荧光淬灭，二周围又没有淬灭，形成的。据您经验，片子干了缺水会拍出黑洞吗？

capchaline据您经验，片子干了缺水会拍出黑洞吗？干片的话会产生更多的非特异性染色，结果不可靠的。我上面说的黑洞的产生，是指荧光淬灭，不管是特异性还是非特异性的，只要有荧光出现了局部淬灭，就会出现类似黑洞的现象。干片和黑洞，个人认为没有直接关系。建议你上图！！！！！！！