一、位点特异性生物素标记的DNA衍生片段的设计及预备

1.化学反应

2.酶反应

二、蛋白质-DNA复合体的制备及紫外照射

1.轻轻摇动存储瓶，重悬顺磁性小磁珠。取出3u1的溶液转入一个硅化过的1.5ml小离心管中，低速离心。

2.将管放入磁性粒子收集器中，静置30s后去掉上清。

3.用30jullX结合洗脱缓冲液，重悬磁珠，用一微量吸管轻轻混勻，室温孵育磁珠2min。

4.低速离心。

5.将管放人磁性粒子收集器中，静置30s后去上清，重复步骤③?⑤。

6.用10ul2X结合洗脱缓冲液，重悬磁珠，加人2ul60nmol/L生物素标记的位点特异性DNA片段衍生物（从本方案7.1中步骤48获得）。25℃孵育10min，不时轻轻敲打管子以混匀液体。

7.将管子放入磁性粒子收集器中，静置30s后，将上清转入一支新的硅化的L5ml小离心管中。

8.通过比较磁珠和上清的放射量来估算生物素标记位点特异性DNA片段衍生物的结合产率，若结合产率大于或等于80%，可继续以下操作，若产率未达要求，则需从本方案7.1中步骤25开始重复操作。

要点：这一步及以后的操作步骤都需在暗光条件下完成。必须避免荧光和日光照射，可采用低等或中等的发热光源（如60W钨灯泡灯）。

9.用30ul1X结合洗脱缓冲液，重悬磁珠，低速离心。

10.将管放人磁性粒子收集器中，静置30s后去掉上清。

11.用30ullX结合洗脱缓冲液，重悬磁珠，低速离心。

12.将管放人磁性粒子收集器中，静置30s后去掉上清。

13.用1X蛋白质结合缓冲液重悬磁珠，使DNA达到预定浓度，加入预定浓度的蛋白质，在合适的温度下，经合适的时间孵育混合液，孵育过程中不时轻轻敲打管子侧壁，以使液体充分混匀。

在这一步及下面的操作中，DNA和蛋白质的浓度、反应的温度和时间都根据以往的经验进行设定，或是根据已知的复合体内各组分相互作用的知识来确定。

14.低速离心。

15.将管放入磁性粒子收集器中，静置10s后弃上清。

16.用预先孵育到合适温度的50ul1X蛋白结合缓冲液，重悬磁珠，在合适的温度下孵育2min。

17.将管子放人磁性粒子收集器中，静置30s后弃掉上清。

任选：在这一步里，可以加入增强子、抑制子或效应分子（见Kim，etal，2000a;Naryshkin，etal，2000)。

18.用预先孵育到合适温度的20ul1X蛋白结合缓冲液重悬磁珠，将混合液转入一支聚苯乙烯小离心管中，而后将管子插人一支预先孵育到合适温度的13mmX100mm的硼硅酸玻璃培养管中。

19.将管子放人光化学反应发生器中，用紫外线照射蛋白质DNA样品20s(11ml/mm2于350nm)。

如果所需的反应温度高于或低于周围环境的温度至少10°C的话，可在硼硅酸玻璃培养菅中注满H2O,而后对其进行预孵育，直至H2O的温度达到合适的温度为止。

20.将悬液转入一支硅化的1.5ml小离心管中，加入7ul的终止反应溶液，振荡混匀。

21.将管放入磁性粒子收集器中，静置10s，取出17ul的上清，立即进行第三部分的操作。

三、核酸酶消化

四、发生交联反应的蛋白质的鉴定