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细胞免疫荧光步骤
免疫荧光技术(Immunofluorescencetechnique)又称荧光抗体技术,是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合,利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。
一、实验材料
1.细胞样品
2.试剂、试剂盒: 多聚甲醛;70%甲醇;丙酮;PBS;Triton;BSA;DAPI染液;DABCO;Tris;甘油
3.仪器、耗材:玻片
二、实验步骤
细胞爬片免疫荧光实验步骤
第一天:
1.在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次,每次3min;
2.用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次,每次3min;
3.0.5%TritonX-100(PBS配制)室温通透20min(细胞膜上表达的抗原省略此步骤);
4.PBS浸洗玻片3次,每次3min,吸水纸吸干PBS,在玻片上滴加正常山羊血清,室温封闭30min;
5.吸水纸吸掉封闭液,不洗,每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒,4℃孵育过夜;
第二天:
6.加荧光二抗:PBST浸洗爬片3次,每次3min,吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗,湿盒中20-37℃孵育1h,PBST浸洗切片3次,每次3min;注意:从加荧光二抗起,后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。
7.复染核:滴加DAPI避光孵育5min,对标本进行染核,PBST5min×4次洗去多余的DAPI;
8.用吸水纸吸干爬片上的液体,用含抗荧光淬灭剂的封片液封片,然后在荧光显微镜下观察采集图像。
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