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RAW细胞,6孔板,RIPA提取蛋白(提前加好PMAF),每孔100uLRIPA,冰上用tip倒过来刮细胞,放置15min,12000gX15min离心,取上清。做WB时,沸水煮5min,胶冻样物质还是存在。
操作过程中发现离心后还是有胶冻样物质,和上清混在一起无法分开,严重的时候基本上全是胶冻样物质。
这个胶冻样物质应该是DNA,园友提供的方法为用超声碎裂器,但是我们实验室没有。请问还有别的方法可以使用么?
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回复:时间:2016-07-02
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回复:时间:2016-06-29
展开引用xiaoer25claire萱RAW细胞,6孔板,RIPA提取蛋白(提前加好PMAF),每孔100uLRIPA,冰上用tip倒过来刮细胞,放置15min,12000gX15min离心,取上清。做WB时,沸水煮5min,胶冻样物质还是存在。操作过程中发现离心后还是有胶冻样物质,和上清混在一起无法分开,严重的时候基本上全是胶冻样物质。这个胶冻样物质应该是DNA,园友提供的方法为用超声碎裂器,但是我们实验室没有。请问还有别的方法可以使用么?楼上的问题我们在提取过程中也遇到过,解决方案有两个:一、增加裂解液RIPA的量,用枪头吸打混匀。一般出现胶状的话,枪头吸打混匀时就会发现是否有胶状。来增加或减少RIPA的量。(我们实验发现如出现胶状,蛋白浓度反而低)二、采用超声破碎一下。一般都能解决这个问题,我们采用方法一为多。友情提示下,PMSF最好是在用使用之前用加入,PMSF容易水解,大概遇水30min就会失效,所以最好不要提前很长时间加入PMSF.......请问一下如果PMSF容易水解的话,那么为什么加入PMSF的LysisBuffer放置-20度冰箱数周后,拿出来溶解还是可以闻到PMSF的味道呢?前提是LysisBuffer已经用过几次,反复冻融,还是可以闻到PMSF的味道
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回复:时间:2016-07-02
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回复:时间:2016-07-05
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回复:时间:2016-07-06
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回复:时间:2016-06-27
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回复:时间:2016-07-06
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回复:时间:2016-07-04
胶冻样的东西是DNARIPA的裂解力度很强推荐六孔板每孔加200微升这样降低DNA的浓度再去煮应该出胶东的可能性就小如果还不行建议改裂解液配方为triton-100或NP-40
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回复:时间:2016-07-06
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回复:时间:2016-06-28
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回复:时间:2016-07-07
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回复:时间:2016-07-04
展开引用xiaoer25claire萱RAW细胞,6孔板,RIPA提取蛋白(提前加好PMAF),每孔100uLRIPA,冰上用tip倒过来刮细胞,放置15min,12000gX15min离心,取上清。做WB时,沸水煮5min,胶冻样物质还是存在。操作过程中发现离心后还是有胶冻样物质,和上清混在一起无法分开,严重的时候基本上全是胶冻样物质。这个胶冻样物质应该是DNA,园友提供的方法为用超声碎裂器,但是我们实验室没有。请问还有别的方法可以使用么?楼上的问题我们在提取过程中也遇到过,解决方案有两个:一、增加裂解液RIPA的量,用枪头吸打混匀。一般出现胶状的话,枪头吸打混匀时就会发现是否有胶状。来增加或减少RIPA的量。(我们实验发现如出现胶状,蛋白浓度反而低)二、采用超声破碎一下。一般都能解决这个问题,我们采用方法一为多。友情提示下,PMSF最好是在用使用之前用加入,PMSF容易水解,大概遇水30min就会失效,所以最好不要提前很长时间加入PMSF.......请问一下如果PMSF容易水解的话,那么为什么加入PMSF的LysisBuffer放置-20度冰箱数周后,拿出来溶解还是可以闻到PMSF的味道呢?前提是LysisBuffer已经用过几次,反复冻融,还是可以闻到PMSF的味道
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回复:时间:2016-07-05
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回复:时间:2016-06-30
请问可以把使用超声碎裂器提取细胞的方法发给我看一下吗?非常感谢!另外,看看这个有没有帮助?http://wenku.baidu.com/link?url=SgeFb3fszuHss8uqw2hvenhShYED7uGh6B5pGKwnqM1YvJpqOY2JqbSGG6qwcIzqssA3WjHxNqwDPzuNtHK1S5CgVJmNeEeRkcbHZDqvm3W
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6孔板才加100ul裂解液,少了一点,应该加到500-1000ul,用RIPA裂解细胞样品总会出现胶冻样物质,增加裂解液和反复吹打多几次,RAW细胞本来就不太好裂解,需要增加裂解时间到15-20分钟
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回复:时间:2016-07-06
zyz突破局限6孔板才加100ul裂解液,少了一点,应该加到500-1000ul,用RIPA裂解细胞样品总会出现胶冻样物质,增加裂解液和反复吹打多几次,RAW细胞本来就不太好裂解,需要增加裂解时间到15-20分钟而且在6孔板中裂解,裂解20分钟左右后再用tips刮下裂解产物,拿去4度离心,小心吸取上清就行了
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回复:时间:2016-06-29
展开引用JacquelineLiu请问可以把使用超声碎裂器提取细胞的方法发给我看一下吗?非常感谢!另外,看看这个有没有帮助?http://wenku.baidu.com/link?url=SgeFb3fszuHss8uqw2hvenhShYED7uGh6B5pGKwnqM1YvJpqOY2JqbSGG6qwcIzqssA3WjHxNqwDPzuNtHK1S5CgVJmNeEeRkcbHZDqvm3W......非常不好意思呀,我们实验室没有超市碎裂器,所以我也不知道具体的方法呢,建议你@其他大神试试哈
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