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免疫球蛋白标记技术一荧光素标记抗体技术
mayitao
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| 实验方法原理 | 目前用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素（Fluoresceinisothiocynate，FITC）或罗达明（LissaminerhodamineB200，RB200）。在碱性条件下FITC的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合，标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力。在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。 |
|---|---|
| 实验材料 | 抗体 |
| 试剂、试剂盒 | FITCPBSDMSO碳酸盐缓冲液 |
| 仪器、耗材 | 搅拌器紫外分光光度计 |
| 实验步骤 | 1. 将纯化的IgG抗体对PH9～9.5碳酸盐缓冲液透析过夜，透析后抗体液移入小烧杯中 2. 称取适量IFTC，加入二甲亚砜（DMSO）（FITC～1mg/1mlDMSO），使终浓度为1mgFITC/1mlDMSO FITC/IgG比例 如IgG浓度为1mg/ml，FITC/IgG比例约为50μgFITC/mgIgG； 如IgG为5～10mg/ml，则比例为25μgFITC/mlIgG 在10ml小烧杯中先放入抗体 3. 按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中 4. 将标记物用PBS加至2.5ml，磁力搅拌器室温下避光搅拌2h，用PD10柱（SephadexG25柱）除去游离荧光素，先用25mlPBS淋洗G25柱。收集PBS洗脱第一个荧光素结合蛋白峰，测定F/P比值。第二个荧光素峰为游离荧光素。 计算： 2.87×A495 F/P＝──────── A280-0.35×A495 合适的F/P值为2～4。 |
| 注意事项 | 1. FITC保存于4℃暗处，使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取，以避免潮解。 2. FITC-DMSO液要临用时配制。 3. 碳酸盐缓冲液要新鲜配制。 |
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