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毛细管区带电泳（CZE）分离硝基苯酚异构体实验

蚂蚁淘 /发布时间:1533849386 /浏览量:81

实验方法原理	毛细管电泳（capillaryelectrophoresis,CE）：以高压电场为驱动力，以电解质为电泳介质，以毛细管为分离通道，样品组分依据淌度和分配行为的差异而实现分离的一种色谱方法。由于毛细管内径小，表面积和体积的比值大，易于散热，因此毛细管电泳可以减少焦耳热的产生,这是CE和传统电泳技术的根本区别。它有多种分离模式，可以采用液相色谱中的各种检测方法。CE既可以分离带电荷的溶质，也可以通过毛细管胶束电动色谱等分离模式分析中性溶质，CE的高分离效率、高检测灵敏度，样品用量极少等特点使它在生物医药样品的分析中显示出突出的优越性。 CE所用的石英毛细管柱，在pH>3.0情况下，其内表面带负电，和溶液接触时形成了一双电层。在高电压作用下，一定介质中的带电离子在直流电场作用下的定向运动称为电泳。单位电场下的电泳速度称为电泳淌度或电泳迁移率。电泳速度的大小与电场强度、介质特性、粒子的有效电荷及其大小和形状有关。而双电层中的水合阳离子引起流体整体地朝负极方向移动的现象叫电渗，单位电场下的电渗速度称为电渗淌度。电渗速度与毛细管中电解质溶液的介电常数和粘度、双电层的ζ电势以及外加直流电场强度有关。粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流(EOF)两种速度的矢量和，正离子的运动方向和电渗流一致，故最先流出；中性粒子的电泳流速度为“零”，故其迁移速度相当于电渗流速度；负离子的运动方向和电渗流方向相反，但因电渗流速度一般都大于电泳流速度，故它将在中性粒子之后流出，从而因各种粒子迁移速度不同而实现分离。电渗是CE中推动流体前进的驱动力，它使整个流体像一个塞子一样以均匀速度向前运动，使整个流型呈近似扁平型的“塞式流”。它使溶质区带在毛细管内原则上不会扩张。但在HPLC中,采用的压力驱动方式使柱中流体呈抛物线型，其中心处速度是平均速度的两倍，导致溶质区带本身扩张，引起柱效下降，使其分离效率不如CE。硝基苯酚是弱酸性物质，其邻、间、对位异构体由于pKa值不同，在一定pH值的缓冲溶液中电离程度不同。因此，它们在毛细管电泳分离过程中表现出不同的迁移速度，从而实现分离。
实验步骤	1.打开毛细管电泳仪，预热至检测器输出信号稳定。 2.准确测量毛细管长度。距毛细管一端约15cm处去除约2mm的毛细管聚合物保护层，作为检测窗口，并测量毛细管进样端到检测窗的长度。 3.将毛细管的检测窗口对准检测器光路，并安装好毛细管。 4.依次用氢氧化钠溶液（1.0mol·L-1）、二次蒸馏水、盐酸溶液（0.1mol·L-1）、二次蒸馏水冲洗毛细管各5min，最后在毛细管注入缓冲溶液，并将毛细管的两端分别插入位于电极处的缓冲溶液瓶中。将直流电压调至20kV。 5.待记录仪基线稳定后，关闭高压电源，用压力进样方式进样，并设定进样时间，待样品峰出现后记录其迁移时间，混合样按同样步骤进行操作，并记录图谱。 6.改变外加电压（如15kV或25kV）重复步骤4、5。 7.实验完毕后，关闭仪器电源，并用二次蒸馏水冲洗毛细管。展开
其他	1.根据所得到的实验数据，计算电渗速度、电渗淌度、各组分的电泳淌度、间硝基苯酚的理论塔板数。根据分离图计算各组分之间的分离度。 2.绘制外加电压与电渗速度的关系图，并给予解释。展开

实验方法原理

毛细管电泳（capillaryelectrophoresis,CE）：以高压电场为驱动力，以电解质为电泳介质，以毛细管为分离通道，样品组分依据淌度和分配行为的差异而实现分离的一种色谱方法。由于毛细管内径小，表面积和体积的比值大，易于散热，因此毛细管电泳可以减少焦耳热的产生,这是CE和传统电泳技术的根本区别。它有多种分离模式，可以采用液相色谱中的各种检测方法。CE既可以分离带电荷的溶质，也可以通过毛细管胶束电动色谱等分离模式分析中性溶质，CE的高分离效率、高检测灵敏度，样品用量极少等特点使它在生物医药样品的分析中显示出突出的优越性。

CE所用的石英毛细管柱，在pH>3.0情况下，其内表面带负电，和溶液接触时形成了一双电层。在高电压作用下，一定介质中的带电离子在直流电场作用下的定向运动称为电泳。单位电场下的电泳速度称为电泳淌度或电泳迁移率。电泳速度的大小与电场强度、介质特性、粒子的有效电荷及其大小和形状有关。而双电层中的水合阳离子引起流体整体地朝负极方向移动的现象叫电渗，单位电场下的电渗速度称为电渗淌度。电渗速度与毛细管中电解质溶液的介电常数和粘度、双电层的ζ电势以及外加直流电场强度有关。粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流(EOF)两种速度的矢量和，正离子的运动方向和电渗流一致，故最先流出；中性粒子的电泳流速度为“零”，故其迁移速度相当于电渗流速度；负离子的运动方向和电渗流方向相反，但因电渗流速度一般都大于电泳流速度，故它将在中性粒子之后流出，从而因各种粒子迁移速度不同而实现分离。

电渗是CE中推动流体前进的驱动力，它使整个流体像一个塞子一样以均匀速度向前运动，使整个流型呈近似扁平型的“塞式流”。它使溶质区带在毛细管内原则上不会扩张。但在HPLC中,采用的压力驱动方式使柱中流体呈抛物线型，其中心处速度是平均速度的两倍，导致溶质区带本身扩张，引起柱效下降，使其分离效率不如CE。

硝基苯酚是弱酸性物质，其邻、间、对位异构体由于pKa值不同，在一定pH值的缓冲溶液中电离程度不同。因此，它们在毛细管电泳分离过程中表现出不同的迁移速度，从而实现分离。

实验步骤

1.打开毛细管电泳仪，预热至检测器输出信号稳定。

2.准确测量毛细管长度。距毛细管一端约15cm处去除约2mm的毛细管聚合物保护层，作为检测窗口，并测量毛细管进样端到检测窗的长度。

3.将毛细管的检测窗口对准检测器光路，并安装好毛细管。

4.依次用氢氧化钠溶液（1.0mol·L-1）、二次蒸馏水、盐酸溶液（0.1mol·L-1）、二次蒸馏水冲洗毛细管各5min，最后在毛细管注入缓冲溶液，并将毛细管的两端分别插入位于电极处的缓冲溶液瓶中。将直流电压调至20kV。

5.待记录仪基线稳定后，关闭高压电源，用压力进样方式进样，并设定进样时间，待样品峰出现后记录其迁移时间，混合样按同样步骤进行操作，并记录图谱。

6.改变外加电压（如15kV或25kV）重复步骤4、5。

7.实验完毕后，关闭仪器电源，并用二次蒸馏水冲洗毛细管。

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其他

1.根据所得到的实验数据，计算电渗速度、电渗淌度、各组分的电泳淌度、间硝基苯酚的理论塔板数。根据分离图计算各组分之间的分离度。

2.绘制外加电压与电渗速度的关系图，并给予解释。

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