一、材料

1.缓冲液和溶液

醋酸铵（10mol/L)(替代透析的一种选择，步聚9)

透析缓冲液（替代乙醇沉淀的一种选择，步骤9)（50mmol/LTris-Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)，准备4份4L透析液并于4℃保存）

乙醇（替代透析的一种选择，步骤9)

裂解缓冲液（10mmol/LTris-Cl(pH8.0)，0.1mol/LEDTA(pH8.0），0.5%(m/V)SDS，20μg/mg无DNase的胰RNase）

苯酚，用0.5mol/LTris-Cl(pH8.0)平衡

TE(pH8.0)

Tris-缓冲盐溶液（TBS)

2.酶和缓冲液

蛋白酶K(20mg/ml)

3.凝胶

脉冲电场凝胶或传统的水平0.6%琼脂糖凝胶

4.核酸和寡核苷酸

完整的噬菌体λDNA

5.离心机和转头

Sorvall离心机及H1000B、SS-34转头（或其他相当的设备）

6.专用设备

尖头切断的黄色尖头

透析管夹

振荡平台或透析管

Shepherd氏钩（替代透析的一种选择）

分光光度计或荧光计

旋转器

真空抽干仪

50℃水浴

宽口移液管（开口处直径0.3cm)

7.细胞和组织

单层或悬浮培养的哺乳动物细胞、新鲜组织或者血样

二、方法

以下是4种裂解不同类型细胞和组织样品不同版本的步骤1。根据研究材料选用合适的方法裂解后步骤2。

1.单层培养细胞的裂解



最好一次做10~12个培养皿，其余的保存在孵箱中，用前取出。

(1)长满单层细胞的一批培养皿从孵箱中取出，迅速吸去培养液，并用冰冷的TBS洗2次。小心加入10mlTBS,轻轻旋转数秒，将溶液倒入2L烧杯中。加入10ml冰冷的TBS并置于冰上。重复此过程将整批细胞做完。

(2)TBS溶液倒入2L烧杯，并吸去剩余的溶液。加入1ml新鲜的冰冷TBS,并将培养皿置于冰上。重复此过程将整批细胞做完。

(3)用一橡胶刮棒将细胞刮入1mlTBS中。用巴斯德移液管将细胞悬液转移到冰上的离心管中。用0.5ml冰冷的TBS冲洗培养皿，并入离心管中的细胞悬液。重复此过程将整批细胞做完。

(4)于1500g(约2700r/min)离心10min以收集细胞。

(5)将细胞重悬于5~10倍体积的冰冷TBS中并再度离心。

(6)用TE(pH8.0)重悬细胞至浓度为5X10⁷个/ml,转移至一个三角锥瓶中。

(7)每毫升细胞悬液加10ml裂解缓冲液，并于37℃孵育1h,立即进行步骤2。

2.悬浮培养细胞的裂解



(1)将细胞转移至离心管并于4℃1500g(SorvallH100B转头，2700r/min)离心10min以收集细胞。吸去上清。

(2)用1倍体积冰冷的TBS重悬细胞并再度离心。吸去上清，小心地再次重悬细胞于冰冷的TBS中，离心收集细胞。

(3)去上清，小心用TE(pH8.0)重悬细胞至5X10⁷个/ml,转移上清至三角锥瓶。

(4)每毫升细胞悬液加10ml裂解缓冲液，并于37℃温育1h,立即进行步骤2。

3.组织样品的裂解

由于组织通常含有大量纤维物质，很难从中获得高产量的基因组DNA。在裂解之前将组织粉碎极大地提高抽提效率。大量的新鲜组织（>1g）可用Waring搅拌器粉碎。



组织样品的研磨

(1)将1g新鲜切取的组织样品置于盛有液氮Waring搅切器的不锈钢杯中，以最高速度将组织粉碎。

(2)液氮挥发，将组织粉末一点一点地加入盛有10倍体积（m/V)裂解液的烧杯中，使其分散于裂解液表面，而后振摇烧杯使粉末浸没。

(3)其完全分散于溶液中，将悬液转移至50ml离心管，并于37℃温育1h,立即进行步骤2。

4.新鲜抽取或冻存血细胞的裂解



(1)从新鲜抽取或冻存样品中收集血细胞（人类血液需由熟练的采血师在无菌环境下抽取）

从新鲜血样中收集血细胞

①收集20ml新鲜血液于含有3.5ml柠檬酸葡萄糖溶液B(ACD)或者EDTA的小管中。

②血样转移至离心管并于4℃1300g(SorvallH100B转头，2500r/min)离心15min。

③吸去上清。用巴斯德移液管将淡黄色层小心转移至新管中并再次离心。弃去红细胞沉淀。

淡黄色层为密度不均一的白细胞宽带。

④将淡黄色层重悬于15ml裂解缓冲液中，并于37℃温育1h,然后进行步骤2。

从冻存血样中收集血细胞

①收集20ml新鲜血液于含有3.5ml柠檬酸葡萄糖溶液B(ACD)或者EDTA的小管中。

血样可于0℃保存数天并于-70℃无限期保存。

②室温水浴中解冻血样并转移至离心管，加入等体积磷酸盐缓冲液。

③于室温3500g(SorvallSS-34转头，5400r/min)离心15min。

④吸去含有裂解红细胞的上清。将沉淀重悬于15ml裂解缓冲液。并于37℃温育1h,然后进行步骤2。

用蛋白酶K和苯酚处理细胞裂解液

2.将裂解液转移至一个或者多个适合SorvallSS-34转头的离心管中，裂解液不能超过1/3体积。

3.加入蛋白酶K(20mg/ml)至终浓度100μg/ml。用一玻棒温和地将酶混入黏滞的细胞裂解液中。

4.将细胞裂解液置于50℃水浴中3h,不时旋转黏滞的溶液。

5.将溶液冷却至室温，加入等体积的用0.1moI/LTris-Cl(pH8.0)平衡过的苯酚。将离心管置于旋转器上，使离心管缓慢颠转10min以温和地混合两相。如此时两相未能形成乳浊液，则将离心管置于旋转器上1h。

6.室温5000g(SorvallSS-34转头，6500r/min)离心15min以分离两相。

7.用宽口移液管（出口直径0.3cm）将黏滞的水相转移至另一离心管。

8.用苯酚再抽提两次，收集水相。

9.用以下2种方法之一分离DNA。

(1)分离大小为150~200kb的DNA

①将水相转移至透析袋，透析袋顶部用透析管夹封口，袋中留有使样品体积增加1.5~2倍体积的空间。

②于4℃在4L透析缓冲液中透析，其间换3次缓冲液，每次间隔6h。

由于DNA黏性很高，透析通常要超过24h才能完成。

(2)分离平均大小为100~150kb的DNA

①第三次用酚抽提后，将水相转移至另一离心管中0.2倍体积10mol/L醋酸铵及2倍体积乙醇，旋转离心管直至溶液彻底混匀为止。

②DNA随即形成沉淀。用Shepherd氏钩（末端封口并拉制成U型的巴斯德移液管)将DNA沉淀从乙醇溶液中移出，污染的寡核苷酸仍留在其中。

③如果DNA沉淀成为碎片，不用Shepherd氏钩而在室温5000g离心5min收集沉淀。

④用70%乙醇洗涤DNA沉淀2次，按步骤③离心收集DNA。

⑤尽可能用真空泵吸去残余的乙醇。于室温将DNA沉淀置于敞开的管内，直至可见的痕量乙醇挥发殆尽。

不要使DNA沉淀完全干燥，否则DNA将极难溶解。

⑥按每0.1ml细胞（步骤1)加入1mlTE。将其置于摇床平台上，于4℃温和振摇12~24h直至DNA完全溶解。将DNA溶液储于4℃。

10.测定DNA的浓度。

11.用脉冲凝胶电泳或者常规的0.6%琼脂糖凝胶电泳分析制备的高分子质量DNA的质量。用λDNA单体或者线性多联体作为分子质量标记物。