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特异性酯酶:氯乙酸 ASD萘酚酯酶(NCE)染色实验

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实验方法原理细胞内酯酶水解合成的底物萘酚酯(一种萘的衍生物)而释放出萘酚,并迅速与重氮盐偶联结果在酶活性部位有明亮色彩的沉淀物出现.
试剂、试剂盒
实验步骤
一、实验试剂:

(一)底物混合液

(1)0.067mol/L 磷酸盐缓冲液(PH7.6)

(2)六偶氮化新品红(hexoliaed new  fuchsin)溶液(新鲜配制)

①溶解新品红(new fuchisn)1g于2mol/L盐酸液25ml中,溶液可长期保存。

②40g/L亚硝酸钠溶液,4℃保存,每周必须新鲜配制,使用前将等体积新品红溶液和40g/L亚硝酸钠溶液混合,反应1min此液好为六偶氮化新品红

③氯乙酸萘酚AS-D液:取氯乙酸萘酚AS-D(naphtholAS-D hcloroacetate)5mg溶于N,N-二甲基酰胺N,N-dimethformamide)2.5ml中。

④将氯化萘酚AS-D溶液2.5ml和六偶氮化新品红0.25ml加至0.067mol/L磷酸盐缓冲液47.5ml中测PH值并调节至7.4不需要即可使用。

(二)复染液:取harris苏木素(含少量明矾)复染液100ml,加冰乙酸4ml,混匀。

(三)稀氨水洗液:每100ml蒸馏水中加入浓氨水(28%)0.2-0.3ml混匀。

二、实验操作:

1.将己固定好的血片或骨髓片放入底物混合液中,在高温温1育10min后,用流水冲洗.

2.用复染液复染10min

3.用稀氨水洗液冲洗玻片直至颜色由红变蓝

4.迅速用流水冲洗,空气中干燥后油镜检查。

三、实验结果判定:阳性反应为红色颗粒.定位于胞浆中,
注意事项
l.氯乙酸萘酚酯酸(NCE)最佳反应PH7.O-7.6之间,它不被氟化钠所抑制.

2.严格遵照操作规程,如增加温度和PH值可导致氯化乙酸萘酚分解,从而在细胞内产生明显的非特异性酯酶反应。

3.除本法采用新品红(newfachsin)外还有人选用坚固紫(fastgarnet,GBC)或坚固蓝(fast blue ,BBN)