材料

步骤

无菌环境，细胞培养所必需

大部分的细胞培养过程需在超净工作台内进行。只要正确灭菌，就可以防止空气中的微生物污染培养基。

工作台灭菌

在每一次实验之前都要按以下程序严格执行，直到关闭工作台。

1.打开工作台鼓风机，产生气流。

2.用70%乙醇喷洒工作台里的全部表面.

3.乙醇浸湿纸巾；擦拭工作台里的所有表面（从瓶中喷洒的乙醇会损伤滤器)。

4.等待工作台晾干，必要时再喷1次。

注意：从这一步起，到在工作台内工作之前都要用乙醇喷手。

5.70%乙醇浸泡所有的待用器械（镊子、剪刀、解剖盘等)，放在工作台里晾干。

6.由于在细胞培养中用到的溶液都是无菌的（包括抗生素盐水、特殊培养基、条件培养基、lmol/L的葡萄糖)，所有的瓶子都应在适当消毒过的工作台内才能打开。

注意防止意外污染

不要在工作台旁饮食（尤其是由酵母制成的饮料和食物)。

保持工作台整齐。

任何被暂时拿出工作台的物品在放回之前都要用乙醇喷洒（如镊子)，在工作台内工作之前都要用乙醇喷手，但是不要让乙醇进入培养皿内。

椎实螺的解剖

将去壳的椎实螺浸入10%~25%消毒液Listerine中lOmin。随后用针将其钉在含ABS盐溶液的解剖盘上，在无菌环境下取出中枢神经系统（Syedetal.1990;Ridgwayetal.1991)。

吸取分离细胞

为了防止神经元粘附到吸量管的玻璃壁上，应在吸量管内壁涂上一层Sigmacote或血清。Sigmacote(Sigma目录#SL-2，是一种特殊的桂酮-庚烧溶液）可在玻璃上形成一层牢固的精微薄膜，防止细胞粘附到吸量管上。

第一步

1.用直径1.5mm的毛细玻璃管，注意无毛刺、丝等。

2.在通风橱内，将Sigmacote吸进毛细玻璃管中（通过毛细虹吸作用），并倒转使Sigmacote从另一端流出，重复几次后，令其过夜晾干。注意不要在用于组织培养的超净工作台中操作任何有毒的化学物质，那会严重危害健康！

第二步

用Sigmacote处理过的毛细玻璃管制备细胞分离管。

3.如同制备尖的细胞内电极一样，在电极拉制仪上拉制毛细玻璃管。这样可得到尖端又长又好的电极。

4.用钻石刀笔把电极长长的尖端截去一半。截断处的长度将决定细胞分离吸管的最终直径。

5.在尖端处稍微用力使尖折断。电极会干净地断开。

6.在微熔炉火焰上抛光电极的尖端。这样可除去一些尖锐的棱角，而这些棱角对神经元的存活是有害的。使用微熔炉上的标尺确定尖端的直径。重要的是应注意电极尖端内径总是略大于待分离的细胞体。

7.从微修炉火焰上拿开电极，在Bunsen燃烧器的火焰上抛光其上端的开口处（与尖端相对的另一端)，以防止电极损伤吸管的管道和阻塞吸管尖。

细胞分离

神经元的分离指把单个的细胞体从中枢神经系统分离出来并把它们放在适宜的培养环境中的过程。这是一个非常精密和高度复杂的过程，对于初学者有相当困难。只要多实践、耐心、坚持和不屈不挠，分离单个特定的神经元就会变得相对容易些。下面介绍操作的基本步骤。

注意：所有的步骤都应在超净工作台内无菌操作。

1.把适当数目的中枢环状神经节放在含ABS的falcon3001塑料培养皿内，随后在3个falcon培养皿之间转换，每个培养皿含3mlABS,在每个培养皿中冼（留置）10~15min。当在培养皿之间移换时，用慑子夹住与神经节相连的结缔组织，注意不要损伤神经节。为了避免培养皿之间的交叉感染，除了转移神经节外的其他时间都要加盖。

2.在用抗生素处理期间，准备2个falcon培养皿用于酶处理。在每个培养皿中加入3mlDM，然后分别加入6mg胰蛋白酶或者6mg胰蛋白酶抑制剂（即2mg/ml，最终的容积浓度为0.2%)。适当地在培养皿上作上标记以避免混淆或其他可能的错误。

3.冲洗完毕，把脑组织块（12/皿）转移到含胰蛋白酶和DM的培养皿内，室温下(18~20*C)静置20~25min。每隔5min摇1次，以确保神经节周围的结缔组织能均勻充分地酶解。酶解后，把脑组织转移到含胰蛋白酶抑制剂和DM的培养皿中静置15min。同样，每隔5min摇1次培养皿，以防止进一步的酶消化。

注意：在细胞培养中，酶处理过程也是个最重要的环节之一。不仅选择合适种类的消化酶是关键的，而且把握精确的时间和温度也是关键。如果酶长时间处于室温下，其活性会随时间过度延长而降低。在随后的使用中需采用下述方法之一来补偿：①增加酶的作用时间；②增加酶的浓度。因此，每次使用后，装有消化酶的瓶子应立即放入冰箱。要根据需要培养组织的参数来选择不同的酶类。例如，中枢环状神经节具有广泛的结缔组织鞘，需要选择作用较强的消化酶（如蛋白酶)，且通常需要较长的作用时间。一般认为胶原酶-水解酶效果最好，因为它含有两种酶：胶原酶消化组织间的胶原连接是最好的；而蛋白酶能消化神经节周围的鞘。然而，选择任何一种给定的酶应由「试验」来确定。

4.在无菌的大烧杯中，将750fzl的lmol/L的葡萄糖溶液倒入20ml的DM中制备高渗DM。这一溶液将DM的渗透压从130~145mOsm提高至180~195mOsm。这种高渗的DM能使神经元收缩，从而使其「更坚韧」，以便能抵挡抽取过程。

5.将脑组织移入盛有高渗的DM的解剖盘中，并固定中枢环状神经节。

6.除了进行细胞分离和手术期间，其余时间始终要给解剖盘加盖，以防止溶剂蒸发。这是非常重要的，因为溶剂蒸发会导致DM的渗透压的升高，造成细胞损伤。

7.把大小合适的Sigmacote处理过的玻璃吸管与吸管连接，用乙醇消毒至少5min。在用高渗的DM充灌微量注射器、试管、吸管之前，用ABS将它们（IOml)彻底冲洗。管中或微量注射器内不能有气泡也很关键，否则将会使细胞的抽取难以进行。

8.向细胞培养皿中加入适量的培养基（DM或CM2.5~3ml),并将培养皿放在自制的塑料培养皿支架板的环形分类格内（图12-2A)。所用的细胞培养皿可以是单纯的塑料制品（3001),也可以是在培养皿底部贴上涂有多聚L-赖氨酸的玻璃盖玻片的培养皿。后者更适宜观察神经突起的生长，因为玻璃与塑料相比具有更好的光学清晰度。虽然把玻璃盖玻片附着在塑料培养皿的底部费力些，但这种方法的确有几个优点。例如，用抗生素处理的培养皿都可以重复再粘附玻璃盖玻片。简单地说，在3001培养皿的底部钻一个圆孔，用无毒的材料把玻璃盖玻片粘贴上去，这些培养皿要用超纯水冲洗，并用UV处理。重要的是应用由德国玻璃（BellcoGlass,Inc.BIOLOGicalGlasswareandEquipment,USA)制成的未拋光的、未包被的玻璃盖玻片。这种培养皿为相差显微镜和Nomarski光学显微镜都提供了最好的光学分辨率。

9.用细镊子剔除包绕在每个神经节的外层结缔组织鞘。为避免手的抖动，尽量将前臂，甚至是手腕放在操作台上，将手指固定在解剖盘的两边。注意在去髓鞘过程中，必须聚精会神，细致操作。

10.(用细镊子）剔除包绕每个神经节的内层结缔组织鞘。为防止神经元损伤，通常捏住远离所需神经元的神经节部分并轻轻地撕扯。注意避免用镊子接触胞体以免造成胞体损伤。

11.用两只镊子轻轻挤压所需神经节两端的连接部。这将切断多数神经元的轴突，利于细胞取出。

12.将吸管尖端（用微型操纵器）移到细胞体上方，通过微量注射器给予轻微的负压。细胞体将被轻轻地吸入吸管中。这时，看上去像一个缚在细绳上的气球，即胞体是气球，轴突是绳子。继续给予轻微吸力（图12-2A),直到轴突被突然拉断，胞体进入吸管。

13.当细胞漂进吸管内并且到开口内几毫米时，移动显微镜（用可移动的操作杆）和光源，使培养皿位于中央（图12-2A)。将吸管尖端对着培养皿底部，轻轻吹出细胞。如果操作准确，未损伤的细胞将缓慢地沉落在培养皿底部。

注意：在解剖盘和培养皿之间进行的所有转移都应通过来回移动细胞牵引装置来完成，注意千万不能动细胞培养皿。

14.重复10~13操作步骤以获得足够数量的细胞。重要的是在此过程中避免对皿中的细胞发生物理性干扰。除了神经元之间为化学性突触联系之外，神经元之间总是应保持一定的距离（间距5~10个胞体直径）。如果需要得到稳固的化学性突触，则应将细胞紧密的排放在一起。

15.静置培养皿(过夜)，让细胞贴壁，生长，和/或形成突触。

16.从工作台中拿出镊子、剪刀、微量注射器和试管等器械，用70%的乙醇冲洗后保存。

结果