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质粒DNA导入细菌细胞实验一电转化法
mayitao
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| 实验方法原理 | 高压电转化简单，快捷可靠，而且是目前效率最高的质粒DNA转化大肠杆菌方法。不过该方法需要电转化装置。 |
|---|---|
| 实验材料 | 菌落 |
| 试剂、试剂盒 | LB甘油SOC |
| 仪器、耗材 | 平板离心瓶聚丙烯管电阻器电转化池 |
| 实验步骤 | 1. 接种一个单菌落于5mlLB培养液，37°C温和振摇培养5h或过夜。 2. 将2.5ml培养物加入到盛有500mlLB培养液的2L烧瓶中，37°C，振摇（300r/min）培养至OD600为0.5~0.6。 3. 细菌在冰水浴冷却10~15min，然后转移到预冷的1L离心瓶中。 4. 于2°C，5000g离心20min，弃上清，沉淀用5ml预冷的水溶解。 5. 加入500ml冰冷的水，混匀，按步骤3重复离心1次。 6. 立即将上清倒掉，用残余的液体重悬细胞。重复步骤5。 7. 立即将上清倒掉，用残余的液体重悬细胞。 8. （1）对于立即使用 将悬浮液加入到预冷的50ml聚丙烯管中，2°C5000g离心10min。置冰上，估计细胞沉淀的体积（约500 μl/500ml培养液），沉淀用等体积的冰冷水重悬，并按50~300 μl分装于预冷的微量离心管中。 新鲜制备的细菌其转化效率要高于冻存的细菌。细胞密度大约2X1011 细胞/ml。 （2）冻存细菌 加入40ml冰冷的10%（V/V）甘油，混合，然后按照步骤（1）离心，估计沉淀的体积，然后加入等体积的冰冷的10%甘油，重悬菌体。按50~300 μl分装于预冷的微量离心管中。于干冰上冷冻并储存于-80°C。 9. 为检测感受态的效果，按照以下各步骤将PBR322转化到感受态细菌。将合适体积的转化物（1、10和25 μl)涂于含有氨苄青霉素的LB平板上，37°C培养过夜。 计算转化率 每微克DNA=每滴液体体积（μl）含有的克隆数X105。 新鲜生长的细胞，一般都有>109 克隆数/μgDNA。 有2.5X1010~14X1010 转化子/μg。 10. 将电转化仪调到2.5kV、25 μF，脉冲控制器调到200~400Ω。 11. 将1 μl质粒DNA（5pg~0.5ng）加入到盛有新鲜制备的细菌或融化的冻存细菌的小管中，混匀。 增大DNA体积和高浓度的盐离子（应小于1mmol/L）会降低转化效率。 12. 将转化混合物转移到已放置冰上5min预冷的电转化池中，用Kimwpie吸水纸吸干电转池的外表面，然后放人电转仪中，按操作进行脉冲电转化。 13. 取出电转化池，马上把细胞转移至一个含1ml预热的SOC培养液的无菌培养管中。于37°C，中速振荡培养30~60min。 14. 分小份涂布于含有抗生素的LB平板上，选择和保存转化子。 |
| 注意事项 | 1. 所有与细菌接触的材料都应该是无菌的。 |
| 其他 | 1. 参考文献：Doweretal.，1988；Hanahan，1983。 2. 撰稿人：ChristineE.Seidman，KevinStruhl，andJenSheen |