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质粒DNA导入细菌细胞实验一电转化法
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实验方法原理 | 高压电转化简单,快捷可靠,而且是目前效率最高的质粒DNA转化大肠杆菌方法。不过该方法需要电转化装置。 |
---|---|
实验材料 | 菌落 |
试剂、试剂盒 | LB甘油SOC |
仪器、耗材 | 平板离心瓶聚丙烯管电阻器电转化池 |
实验步骤 | 1. 接种一个单菌落于5mlLB培养液,37°C温和振摇培养5h或过夜。 2. 将2.5ml培养物加入到盛有500mlLB培养液的2L烧瓶中,37°C,振摇(300r/min)培养至OD600为0.5~0.6。 3. 细菌在冰水浴冷却10~15min,然后转移到预冷的1L离心瓶中。 4. 于2°C,5000g离心20min,弃上清,沉淀用5ml预冷的水溶解。 5. 加入500ml冰冷的水,混匀,按步骤3重复离心1次。 6. 立即将上清倒掉,用残余的液体重悬细胞。重复步骤5。 7. 立即将上清倒掉,用残余的液体重悬细胞。 8. (1)对于立即使用 将悬浮液加入到预冷的50ml聚丙烯管中,2°C5000g离心10min。置冰上,估计细胞沉淀的体积(约500 μl/500ml培养液),沉淀用等体积的冰冷水重悬,并按50~300 μl分装于预冷的微量离心管中。 新鲜制备的细菌其转化效率要高于冻存的细菌。细胞密度大约2X1011 细胞/ml。 (2)冻存细菌 加入40ml冰冷的10%(V/V)甘油,混合,然后按照步骤(1)离心,估计沉淀的体积,然后加入等体积的冰冷的10%甘油,重悬菌体。按50~300 μl分装于预冷的微量离心管中。于干冰上冷冻并储存于-80°C。 9. 为检测感受态的效果,按照以下各步骤将PBR322转化到感受态细菌。将合适体积的转化物(1、10和25 μl)涂于含有氨苄青霉素的LB平板上,37°C培养过夜。 计算转化率 每微克DNA=每滴液体体积(μl)含有的克隆数X105。 新鲜生长的细胞,一般都有>109 克隆数/μgDNA。 有2.5X1010~14X1010 转化子/μg。 10. 将电转化仪调到2.5kV、25 μF,脉冲控制器调到200~400Ω。 11. 将1 μl质粒DNA(5pg~0.5ng)加入到盛有新鲜制备的细菌或融化的冻存细菌的小管中,混匀。 增大DNA体积和高浓度的盐离子(应小于1mmol/L)会降低转化效率。 12. 将转化混合物转移到已放置冰上5min预冷的电转化池中,用Kimwpie吸水纸吸干电转池的外表面,然后放人电转仪中,按操作进行脉冲电转化。 13. 取出电转化池,马上把细胞转移至一个含1ml预热的SOC培养液的无菌培养管中。于37°C,中速振荡培养30~60min。 14. 分小份涂布于含有抗生素的LB平板上,选择和保存转化子。 |
注意事项 | 1. 所有与细菌接触的材料都应该是无菌的。 |
其他 | 1. 参考文献:Doweretal.,1988;Hanahan,1983。 2. 撰稿人:ChristineE.Seidman,KevinStruhl,andJenSheen |