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回复:时间:2004-07-22
是啊!我用丙酮沉淀,-20过夜后,离心,再用丙酮洗了两遍,洗的时候就觉得沉淀很难吹打开,洗完后我就将EP管开着盖放-20冰箱,第二天发现冻干了,白色粉末状,将其用1×SDS上样缓冲液溶,我个人觉得一点也没有溶,我敲打了一个中午,最后将EP管放在沸水里放了5分钟,感觉好像溶了一点点,就凑合着上样了,电泳的结果是,什么带也没有!快帮忙啊!
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回复:时间:2004-07-26
啊?你就直接将冻成干粉的蛋白溶解到1×SDS上样缓冲溶液中?当然很难溶解.而且蛋白的浓度也很高.蛋白溶解需要高浓度的尿素.你可以将冻成干粉的蛋白再用裂解液裂解,然后再加1×SDS上样缓冲溶液,再上样.
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回复:时间:2004-07-25
claybird 我检索了,很多有关丙酮沉淀的,可是没有找到如何能溶解。战友们,快帮忙啊!偶都溶了一个中午了,现在也没有溶解!!这是老问题。我也困扰了好久。没发现园子里有好的解决办法。加很猛的裂解液只能溶解一部分的。超声倒没试过。
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回复:时间:2004-07-26
一般采用冰浴的方法,先冰浴预冷,然后边冰浴边超声。加尿素可能是一较好的办法,可助溶,同时对SDS-PAGE电泳结果没什么影响。可先用含8M尿素的Buffer悬浮沉淀,超声混匀,再加2Xloading buffer。另外注意一下pH值,使其尽量远离蛋白的PI值,个人认为在碱性的条件下溶解比较好,大多数蛋白在pH高达12时都比较稳定。
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回复:时间:2004-07-23
选用何种Buffer,取决于具体蛋白的情况,一般Buffer的pH值离蛋白PI值越远,蛋白在该Buffer中的溶解越好。常用的Buffer有PB、Tris-Cl、碳酸盐缓冲液等,含8M尿素的Buffer,即将8M尿素溶解在上述Buffer中。根据蛋白样品量,调整加入的Buffer量。将样本用含尿素的Buffer悬浮后,再用2X上样缓冲液处理样本。
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回复:时间:2004-07-30
展开引用claybird 是啊!我用丙酮沉淀,-20过夜后,离心,再用丙酮洗了两遍,洗的时候就觉得沉淀很难吹打开,洗完后我就将EP管开着盖放-20冰箱,第二天发现冻干了,白色粉末状,将其用1×SDS上样缓冲液溶,我个人觉得一点也没有溶,我敲打了一个中午,最后将EP管放在沸水里放了5分钟,感觉好像溶了一点点,就凑合着上样了,电泳的结果是,什么带也没有!快帮忙啊!......我的操作比你的简单很多,就是丙酮沉淀过夜,4度,12000rpm离心30min,倒掉丙酮,直接在室温下让丙酮自然挥发干(反正拿来做SDS)。然后普通的1*SDS上样buffer溶解,用枪头混就可以了,觉得不放心可以用震荡器稍微混一下,然后放沸水煮3-5min就好了。没有碰到那么难溶解的情况啊。
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回复:时间:2004-07-24
zyh218 选用何种Buffer,取决于具体蛋白的情况,一般Buffer的pH值离蛋白PI值越远,蛋白在该Buffer中的溶解越好。常用的Buffer有PB、Tris-Cl、碳酸盐缓冲液等,含8M尿素的Buffer,即将8M尿素溶解在上述Buffer中。根据蛋白样品量,调整加入的Buffer量。将样本用含尿素的Buffer悬浮后,再用2X上样缓冲液处理样本。谢谢zyh218 战友!你能告知这些的buffer的配方吗?
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回复:时间:2004-07-23
偶觉得是不是因为蛋白冻干了,所以比较难溶啊?可不可以这样啊:丙酮-20过夜后离心,待丙酮挥发完后加2×SDS上样buffer溶解,如果溶的好,就立即99度3分钟变性,完了之后再放-20保存。如果溶的不好,就加入等体积的裂解液,再进行后面的步骤,不知这样可行不?
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回复:时间:2004-07-30
为什么不能太高啊?怕不溶?还是浓度太高结果不好?如果是10~20 ug/10~20ul,上样量20ul的话,是不是太少了?我的蛋白不用浓缩也远远超过这个浓度了。
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回复:时间:2004-07-30
浓度高了可能对溶解有影响,并不是浓度高了不好。如果你的蛋白浓度能达到10~20 ug/10~20ul,应该不需要浓缩了。在这个浓度下,上样20ul就有20ug左右的蛋白了,这对考染已经足够了(考染的灵敏度可达到0.1 ug)。不过具体上样多少,还应根据你的实验需要来确定。
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回复:时间:2004-07-26
考染的目的只是看看目的蛋白在什么位置,我们的目的是WB能出较好的带,偶的蛋白浓度是70-80微克/微升,是用紫外法测的,根据公式计算,不很准,但偶没有能直接测蛋白浓度的仪器,也只好如此了。偶觉得偶的蛋白裂解的还不错,浓度也不是很低,就是上样量太少了,所以WB的带老是太弱。
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回复:时间:2004-07-21
zxw_7854 啊?你就直接将冻成干粉的蛋白溶解到1×SDS上样缓冲溶液中?当然很难溶解.而且蛋白的浓度也很高.蛋白溶解需要高浓度的尿素.你可以将冻成干粉的蛋白再用裂解液裂解,然后再加1×SDS上样缓冲溶液,再上样.我的裂解液种含有0.2M的盐酸,如果用冻成干粉的蛋白再用裂解液裂解,就混入了盐离子,对结果会不会有影响?
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