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活体动物荧光成像技术原理及应用
一、技术原理
1.标记原理
活体荧光成像技术主要有三种标记方法。
①荧光蛋白标记:荧光蛋白适用于标记细胞、病毒、基因等,通常使用的是GFP、EGFP、RFP(DsRed)等;
②荧光染料标记:荧光染料标记和体外标记方法相同,常用的有Cy3、Cy5、Cy5.5及Cy7,可以标记抗体、多肽、小分子药物等;
③ 量子点标记:量子点(quantumdot)是一种能发射荧光的半导体纳米微晶体,是由数百到数万个原子组成的原子簇,尺寸在100nm以下,外观恰似一极小的点状物。量子点作为一类新型的荧光标记材料,其在长时间生命活动监测及活体示踪方面具有独特的应用优势。与传统的有机荧光试剂相比较,量子点荧光比有机荧光染料的发射光强的20倍,稳定性强100倍以上,具有荧光发光光谱较窄、量子产率高、不易漂白、激发光谱宽、颜色可调,并且光化学稳定性高,不易分解等诸多优点。主要应用在活细胞实时动态荧光观察与成像,可以在长达数天内进行细胞的分化和世系观察,以及细胞间、细胞内及细胞器间的各种相互作用的原位实时动态示踪。不但如此,量子点还可以标记在其他需要研究的物质上,如药物、特定的生物分子等,示踪其活动及作用。
2.光学原理
荧光发光是通过激发光激发荧光基团到达高能量状态,而后产生发射光。同生物发光在动物体内的穿透性相似,红光的穿透性在小动物体内比蓝绿光的穿透性要好得多,随着发光信号在体内深度的增加,波长越接近900nm的光线穿透能力越强,同时可消减背景噪音的干扰,近红外荧光为观测生理指标的最佳选择。在实验条件允许的条件下,应尽量选择发射波长较长的荧光蛋白或染料。
二、活体动物荧光成像技术应用领域
1.肿瘤学
活体荧光成像技术能够无创伤定量检测小鼠的皮下瘤模型。相对于生物发光成像技术,活体荧光成像技术检测时间较快,只需要不到1s的时间,同时不需要注射底物,节约了检测成本。但是需要选择近红外荧光检测深部组织,目前此波段的荧光蛋白种类有限,精确定量较难。
①GFP标记的肺肿瘤模型(H-460-GFP)
H-460-GFP是一个绿色荧光蛋白表达细胞系,它起源于H-460肺小细胞肺癌,稳定转染了绿色荧光蛋白基因,并由SV-40启动子起始基因的表达。
通过H-460-GFP皮下肿瘤模型,建立小鼠肺癌的实验模型,可用来进行有关抗癌药物的筛选(图1)。可用于测量皮下肿瘤的生长和监测对潜在化学治疗药物的反应。
图1 左图是接种后1w荧光成像,右图是3w荧光成像
②量子点标记细胞系
通过量子点可以标记肿瘤细胞,用量子点Qtracker®705对MDA-MB-231乳腺癌细胞进行标记,皮下接种后动态观察其生长以及变化(图2)。激发光波长625nm,散射光波长680nm。
图2量子点标记肿瘤细胞不同时间荧光成像
2.抗体
分子探针的一端联有能够和生物体内特异靶点结合的分子结构(如肽类、酶的底物、配体等),另一端则是荧光染料。通过Cy5.5标记的抗体的体内代谢实验,可见肝、肾等处的分布(图3)。
图3 Cy5.5标记的抗体的体内代谢实验
3.药学研究
荧光成像在药物制剂学研究,尤其是药物靶向性研究,药物载体研究中有巨大优势。有关专家正在设计用合适的荧光染料标记小分子药物,观察药物在动物体内的特异性分布和代谢情况,尤其是中药研究方面。
应用透射仪从样本底部激发光源,可以提高活体荧光成像的灵敏度和检测的深度。图4是应用NIR荧光染料标记的β淀粉酶来观察治疗Alzheimer病的药物的治疗效果,曝光时间仅为200ms,激发波长680nm,散射光波长720nm。
图4 NIR标记的β淀粉酶成像
4.组织工程
通过发展EGFP基因表达的细胞系无创伤的评价组织工程的构建。通过EGFP标记的组织工程细胞移植到小鼠体内特制的支架上,观察该细胞的生长和变化,从而判断组织工程的成败与否。
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