CMC中效应细胞的制备

1）用淋巴细胞分离液分离PBMC

1．抽取正常人静脉血加到肝素抗凝管中，加2倍量磷酸盐（PBS）悬浮细胞。将此悬液小心加在淋巴细胞分离液上，400×g离心30分钟。

2．离心后红细胞在管底，PBMC在血浆和淋巴细胞分离液的交界面。收集PBMC，用PBS洗涤细胞两次，每次离心150×g10分钟。低速离心可以减少血小板沉淀，但细胞沉淀物较松散，去上清液时注意丢弃细胞。

3．将细胞悬浮于含2％～5％人AB血清的RPMI-1640培养液中，计数细胞，用1％台盼蓝染色检测细胞活力（应>90%），再用同样培养液将细胞配成1×10⁶～2×10⁶/ml。

2）分离大颗粒淋巴细胞

1．配制不连续Percoll梯度：取Percoll原液与10倍浓缩的PBS以9：1的比例混合，此时溶液为100％Percoll，比重是1.127，毫克分子渗透压浓度为290mOsmol/kg。将100％Percoll与含0.75％牛血清蛋白的RPMI-1640培养液混合配成41.1％、45.8％、50.0％和66.6％的Percoll溶液。在41.4％和50.0％Percoll溶液中加一滴0.1％台盼蓝，以便区分个梯度溶液的交界面。

2．在50ml离心管中从下向上依次小心加入66.6％、50.0％、45.8％和41.1％的Percoll溶液各10ml，使分别形成明显的交界面。再小心加水10ml约含5×10⁸PBMC的细胞悬液。水平离心500×g30分钟。

3．分别收集各交界面的细胞，用RPMI-1640培养液洗涤细胞3次，每次离心500×g10分钟。用含2％～5％人AB血清的RPMI-1640培养液将细胞配成适当浓度。LGL的密度较低，主要在41.4％和45.8％的交界面。50％和66.6％交界面细胞主要是T细胞，45.8％和50％交界面细胞是T细胞和LGL的混合物。三个交界面中的细胞都有LAK活性。

3）其它来源的效应细胞

1．无菌摘取胎儿胸腺、胎肝、胎脾或肿瘤的引流淋巴结，置含2％～5％人AB血清的RPMI-1640培养液的平皿中。

2．在无菌操作下，用注射器芯将上述器官挤压通过200目的钢丝网，得到单个细胞。用上述培养液洗涤细胞一次。

3．将细胞悬浮于上述培养液中，计数细胞，用台盼蓝染色检测细胞活力（应>80％），再用同样培养液将细胞配成1×10⁶～2×10⁶/ml。

4）LAK细胞的诱生和扩增

1．向上述各种来源的淋巴细胞悬液中加重组IL-2到1000U/ml。以2×10⁶/ml的细胞浓度，在37℃5％CO₂的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养3～5天，细胞即具有LAK活性。

2．培养3～5天的LAK细胞数量基本没有变化。如需较多的LAK细胞，可以继续培养至2～3周：每当细胞生长到5×10⁶～10×10⁶/ml时分瓶，用同样培养液将细胞配成1×10⁶～2×10⁶/ml，再加IL-2继续培养。

靶细胞的制备（分离肿瘤细胞和TIL）

1．无菌摘取肿瘤，置预冷的含抗生素的RPMI-1640培养液中，剪去结缔组织，剪碎瘤体至1～2mm大小。放置2～10分钟让组织块沉淀，吸去上清液。

2．将沉淀的组织块置5～10倍体积的消化液中，37℃中搅拌或振荡1～4小时或室温过夜。用力吹打组织块，即可得到单个细胞悬液。

3．离心400×g10分钟，除去消化液。用5倍体积的RPMI-1640培养液悬浮细胞。将细胞悬液小心加到双层淋巴细胞分离液上。

4．离心400×g30分钟，上层分界面是新鲜肿瘤细胞，下层分界面是肿瘤组织中的淋巴细胞（TIL），可用于诱导杀伤活性和扩增。

5．用RPMI-1640培养液洗涤肿瘤细胞两次，用作检测LAK细胞活性的靶细胞。此细胞可以在含50％人AB血清和10％二甲基亚砜（DMSO）的RPMI-1640培养液中以1×10⁷～5×10⁷/ml的浓度置液氮中冻存，用前复苏。