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实验方法原理	流式细胞仪的使用一般分为三个步骤。第一，是仪器前阶段，包括试剂的准备，细胞制备、细胞的荧光染色；第二，是流式细胞仪阶段，主要是仪器的操作；第三，是结果分析阶段。
实验材料	淋巴细胞外周血的白细胞
试剂、试剂盒	FACS缓冲液PBS叠氮钠溶液仪器缓冲液FACS清洁液FACS洗净液
仪器、耗材	流式细胞仪
实验步骤	一、细胞和试剂的准备 1. 细胞样品：来源淋巴细胞或外周血的白细胞。 2. 荧光标记单克隆抗体：常用的有FITC（fluorescein-isothiocyanate）和PE（phycoerythrin）标记的单克隆抗体。 3. 封闭抗体：抗Fc受体抗体   4. FACS缓冲液： 1×PBS 950ml FCS 40ml 10%叠氮钠溶液 10ml 5. 仪器缓冲液（FACS-flow）：仪器厂家提供 6. FACS清洁液（FACSclean）和FACS洗净液（FACSrinse）：仪器厂家提供。 二、操作步骤   1. 单细胞悬液的制备：将1×105~1×107的细胞放入1.5ml离心管中3000r/min离心5分钟，弃上清；加入FACS缓冲液100μl悬浮细胞。 2. 封闭细胞表面Fc受体：在步骤1中加入Fc受体抗体0.5μl（0.5mg/ml），水浴3分钟。 3. 细胞与荧光抗体结合：在步骤2中加入荧光抗体1μl（0.5mg/ml），水浴30分钟。 4. 洗细胞去除游离的荧光抗体：在步骤3中加入FACS缓冲液350μl，轻轻混匀，3000r/min，离心5分钟，弃上清，重复步骤（4）2次。 5. 上样前处理：取100μl仪器缓冲液加入步骤（4）获得的细胞沉淀中，轻轻混匀悬浮细胞，将细胞悬液移入FACS专用管中，准备进行仪器检测和分析。 三、仪器的操作 以FACSCaliburTM（BDBiosciences）仪器为例。仪器主要分为主机部分（包括激光激活源，射流，射线探测器）和计算机部分（CELLQuestsoftwere）。仪器的操作分为使用前的准备、使用中的操作和使用后的清洗。 1.使用前的准备 （1）打开电源：包括系统电源和主机部分电源。 （2）检查供液槽和废液槽：供液槽应含足够的仪器缓冲液，废液槽应在上次使用后清洗干净。 （3）使机器处于负亚状态，才能使细胞悬液被吸入至机器的吸管口。 （4）机器处于可应用状态时，指示灯会变成绿色。 2.使用中的操作 （1）计算机部分—使用CELLQuest程序系统软件： ①设定所要检测细胞的数量：一般设10000~20000个细胞。 ②命名本次实验：一般含使用者的姓名和实验日期。 ③打开记数部分：显示进入的细胞数以及检测一定量的细胞所需要的时间。 ④将微机与主机连接：控制检测时的预检测和实际检测。 ⑤主机设定：一般是已设定好的适合测定淋巴细胞的条件，包括探测器的电压。探测器的电压是调空光电倍增管所能检测荧光密度的范围。 ⑥选择检测的波长和表达方式（plot）：如果用一种荧光抗体，一般选直方图（histogram）；如果用两种荧光抗体，常选点状二维图（dotplot）或轮廓线图（contourplot）表  CD69分子表达检测直方图的数值说明     b.abti-CD3（2ng/ml）检测结果     c.abti-CD3（10ng/ml）检测结果     CD4及CD8细胞点状二维图结果     不同的荧光物要求选择不同的激发波长，参见下表     （2）细胞的吸入：将装有细胞的FACS测定管放置到机器吸管孔处。 先预检测样品，然后进行实际检测。可根据细胞的浓度选择测定的速度（低、中或高）。所有的数据将自动存入微机。 3.使用后的清洗 所有样品测定完后，要进行仪器的清洗。 （1）将装FACS清洁液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入1分钟。 （2）将装FACS洗净液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入1分钟。 （3）再将装FACS清洁液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入5分钟。 （4）同样再将装FACS洗净液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入5分钟。 （5）最后将一装有双蒸水的FACS管放置机器吸管孔后，关闭机器。 （6）将废液槽中的废液倒掉，并清洗干净废液槽。
注意事项	1. 减少非特异荧光染色 （1）细胞的活性和状态：流式细胞仪不但可探测细胞表面的荧光，也可探测细胞内的荧光。因此，如果要检测细胞表面的分子，一定要保证细胞的活性，还应尽可能保持细胞静止，通常在4度进行操作。否则，荧光抗体进入死细胞内，会产生非特异结果。 （2）封闭抗体的应用是必不可少的，因为大多数的免疫细胞表面都表达有Fc-R。细胞与抗体相互作用后，一定要用FACS缓冲液洗2~3次，以除去游离的抗体。 2. 单染色时以FACS最常用，FITC标记抗体荧光比较稳定而且价格合适。 3. 如果同时要检测两种以上的分子，一定要选择不同波长的荧光所标记的抗体。