方案A：细胞悬液的表面抗原染色。
方案B：一步法胞内蛋白染色（细胞核）。

小贴士：
1、流式抗体要储存于避光4度，严格避免冻融。
2、流式抗体使用前要离心3min，避免贴壁盖的损失，请勿斡旋混匀。
3、避免细胞成团，以免堵塞流式细胞仪。
4、eFluor纳米晶体抗体参照该品说明进行改善。

方案A:细胞悬液的表面抗原染色

实验材料：

15×75mm圆底流式管或96孔板
直标一抗或纯化抗体
二抗（可选）
抗小鼠CD32/16抗体（eBioscienceCat.No.14-0161）
人FCR结合抑制剂（eBioscienceCat.No.14-9161）
流式染色液（eBioscienceCat.No.00-4222）可自行配制
eFluor纳米晶体抗体染色液（eBioscienceCat.No.00-3222；可选）
7-AAD活度染色液（eBioscienceCat.No.00-6993）或PI染色液（eBioscienceCat.No.00-6990）

实验流程：
1、按照样品细胞制备方案制备悬浮细胞，调整浓度为2×107/ml。
2、（可选）封闭FCR介导的非特异性反应：
小鼠：染色之前加0.5ug-1ug/100ulCD16/32抗体，孵育20min。
人类：染色之前加20ul人FCR结合抑制剂孵育20min。
3、等分细胞悬液，每管50ul，再补加50ul染色液。
4、按照抗体说明书加入适量抗体，轻弹混匀。
5、直标抗体。

方案B：淋巴组织细胞制备

实验材料：

60×15mm的组织培养皿
[5ml注射器
细胞过滤器（尼龙网过滤）
eBioscience®流式染色缓冲液（eBioscienceCat.No.00-4222）
15ml或50ml的离心管。

注意：
Foxp3Fixation/PermeABIlizationConcentrate1份加3份Diluent稀释为工作液（1:4稀释）。

实验方案：
1、按照流式样品要求制备单细胞悬液。
2、按照流式表面染色方法标记CD3和CD4。缓冲液洗涤一次，离心完全弃上清。斡旋分散细胞。
3、加1mlFoxp3Fixation/permeabilization工作液，斡旋固定细胞。室温或四度避光孵育30-60min（小鼠样品zui长可以四度固定18小时）。
4、每管加2ml1×permeabilizationbuffer。
5、300g室温离心5min,弃上清。
6、2ml1×permeabilizationbuffer重悬细胞。
7、300g室温离心5min,弃上清。
8、加100ul1×permeabilizationbuffer重悬细胞后，加入二抗FOXP3（或其他胞内抗原抗体），室温避光孵育20min。
9、2ml1×permeabilizationbuffer洗一次，300g室温离心5min,弃上清。
10、加2ml流式染色液，300g室温离心5min,弃上清。
11、适量流式染色液重悬，即可上机检测。同行对照依照上述步骤进行。软件分析结