1.选择pH范围，计算缓冲与滴定Immobiline的体积

对未知样品pH范围的选择，最好先用宽范围（如pH3.5~10)载体两性电解质等电聚焦确定其等电点的位置，再选择窄范围的固相pH梯度等电聚焦。确定范围后，根据表7.4和7.5査得或进一步用内插法计算得到缓冲和滴定Immobiline的体积。







2.贮液配置

丙烯酰胺单体贮液：溶解14.55g丙烯酰胺和0.45gN,N"-甲叉双丙烯酰胺在35ml双蒸水中，搅拌直至溶解，用双蒸水加至50ml。过滤，溶液可在4℃保存两周。

40%(W/V)过硫酸铵贮液：溶解0.4g过硫酸铵在1ml双蒸水中。溶液必须新鲜配置。

ImmobilineII：使用前将贮存在4~8℃冰箱中的ImmobilineII溶液在室温平衡约0.5小时。

3.模具组装和凝胶溶液的配置

如“水平平板电泳的制胶”组装灌胶模具，但不需要在模具上做加样孔。如欲灌注T=5%、C=3%的凝胶，参见表7.4，表7.5和表7.6。凝胶溶液必须新鲜配置。一般将酸性Immobiline作为重液，碱性Immobiline作为轻液，俗称“酸重碱轻”。如欲提高电泳速度，可加100μl载体两性电解质。



4.灌胶

固相pH梯度的灌胶模具可使用与常规聚丙烯酰胺梯度凝胶和SDS梯度凝胶灌胶相同的模具，参见“水平平板电泳的制胶”。但不需要做加样孔，并且不需要有浓缩胶和分离胶之别。作者实验室曾灌注pH4.4~5.4固相pH梯度胶用于分析Gc蛋白亚型和pH5.05~5.60固相pH梯度凝胶用于分析转铁蛋白。

(1)灌胶前梯度混合器的腔间阀和流出管的夹子都应关闭。

(2)将7.5ml(视凝胶大小而定）轻液（碱性）注入梯度混合器的储液腔。小心打开腔间阀，赶去腔间气泡，再关上腔间阀。若不慎有轻液流入混合腔，则需将轻液吸回储液腔。

(3)将同样体积的重液（酸性）注入梯度混合器的混合腔。在两个腔中分别放入同样大小的搅拌子，在储液腔中放入补偿棒，此时两腔液面应该相平。

(4)将梯度混合器置于磁力搅拌器的最佳位置上。将流出管插入灌胶模具中央。为了控制流速，得到线性梯度，梯度混合器的出口与流出管末端高度相差约5cm。开动磁力搅拌器（200~500r/min)。

(5)在两个腔中各自先加TEMED，再加过硫酸铵。打开流出管的夹子，当酸液流到流出管的一半时，打开腔间阀。两腔中液面同时下降，在混合腔混合后，缓缓注入垂直放置的模具中。

(6)灌注完毕后，在室温静置5~20分钟（可用异丙醇封胶)。放入30~40℃烘箱中聚合。灌胶后，立即洗净梯度混合器，以免堵塞腔间阀。

5.洗胶和吹胶

凝胶聚合约需1小时，从烘箱中取出凝胶模具后，同“薄层分析等电聚焦的方法”方法取出凝胶，标上正、负极。称重后放入双蒸水中（6X10分钟或3X1小时)，室温下振摇约60次/分钟，洗去催化剂和未聚合的单体。洗胶后，用软纸吸去表面的水。用冷风（小电扇）在一定距离约（50cm)吹胶至与洗胶前重量相差小于1%。如果凝胶中含有过多水，影响胶浓度和梯度，在电泳时易在凝胶表面形成水滴，改变导电性干扰聚焦。小于pH8的凝胶至多可保存一周，碱性胶不宜保存。