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固相pH梯度等电聚焦实验一制胶
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实验方法原理 | 固相pH梯度凝胶是由固相pH梯度介质(丙烯酰胺衍生物)共价结合到聚丙烯酰胺凝胶中并形成pH梯度,所以制胶过程比载体两性电解质凝胶复杂。灌胶的方法与常规聚丙烯酰胺梯度凝胶和SDS梯度凝胶相似。高质量的凝胶介质和固相pH梯度介质,聚合过程以及漂洗对固相pH梯度凝胶是非常重要的。 |
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试剂、试剂盒 | 丙烯酰胺单体贮液过硫酸铵贮液 |
仪器、耗材 | 灌胶模具 |
实验步骤 | 1.选择pH范围,计算缓冲与滴定Immobiline的体积 对未知样品pH范围的选择,最好先用宽范围(如pH3.5~10)载体两性电解质等电聚焦确定其等电点的位置,再选择窄范围的固相pH梯度等电聚焦。确定范围后,根据表7.4和7.5査得或进一步用内插法计算得到缓冲和滴定Immobiline的体积。 ![]() ![]() ![]() ![]() 2.贮液配置 丙烯酰胺单体贮液:溶解14.55g丙烯酰胺和0.45gN,N"-甲叉双丙烯酰胺在35ml双蒸水中,搅拌直至溶解,用双蒸水加至50ml。过滤,溶液可在4℃保存两周。 40%(W/V)过硫酸铵贮液:溶解0.4g过硫酸铵在1ml双蒸水中。溶液必须新鲜配置。 ImmobilineII:使用前将贮存在4~8℃冰箱中的ImmobilineII溶液在室温平衡约0.5小时。 3.模具组装和凝胶溶液的配置 如“水平平板电泳的制胶”组装灌胶模具,但不需要在模具上做加样孔。如欲灌注T=5%、C=3%的凝胶,参见表7.4,表7.5和表7.6。凝胶溶液必须新鲜配置。一般将酸性Immobiline作为重液,碱性Immobiline作为轻液,俗称“酸重碱轻”。如欲提高电泳速度,可加100μl载体两性电解质。 ![]() 4.灌胶 固相pH梯度的灌胶模具可使用与常规聚丙烯酰胺梯度凝胶和SDS梯度凝胶灌胶相同的模具,参见“水平平板电泳的制胶”。但不需要做加样孔,并且不需要有浓缩胶和分离胶之别。作者实验室曾灌注pH4.4~5.4固相pH梯度胶用于分析Gc蛋白亚型和pH5.05~5.60固相pH梯度凝胶用于分析转铁蛋白。 (1)灌胶前梯度混合器的腔间阀和流出管的夹子都应关闭。 (2)将7.5ml(视凝胶大小而定)轻液(碱性)注入梯度混合器的储液腔。小心打开腔间阀,赶去腔间气泡,再关上腔间阀。若不慎有轻液流入混合腔,则需将轻液吸回储液腔。 (3)将同样体积的重液(酸性)注入梯度混合器的混合腔。在两个腔中分别放入同样大小的搅拌子,在储液腔中放入补偿棒,此时两腔液面应该相平。 (4)将梯度混合器置于磁力搅拌器的最佳位置上。将流出管插入灌胶模具中央。为了控制流速,得到线性梯度,梯度混合器的出口与流出管末端高度相差约5cm。开动磁力搅拌器(200~500r/min)。 (5)在两个腔中各自先加TEMED,再加过硫酸铵。打开流出管的夹子,当酸液流到流出管的一半时,打开腔间阀。两腔中液面同时下降,在混合腔混合后,缓缓注入垂直放置的模具中。 (6)灌注完毕后,在室温静置5~20分钟(可用异丙醇封胶)。放入30~40℃烘箱中聚合。灌胶后,立即洗净梯度混合器,以免堵塞腔间阀。 5.洗胶和吹胶 凝胶聚合约需1小时,从烘箱中取出凝胶模具后,同“薄层分析等电聚焦的方法”方法取出凝胶,标上正、负极。称重后放入双蒸水中(6X10分钟或3X1小时),室温下振摇约60次/分钟,洗去催化剂和未聚合的单体。洗胶后,用软纸吸去表面的水。用冷风(小电扇)在一定距离约(50cm)吹胶至与洗胶前重量相差小于1%。如果凝胶中含有过多水,影响胶浓度和梯度,在电泳时易在凝胶表面形成水滴,改变导电性干扰聚焦。小于pH8的凝胶至多可保存一周,碱性胶不宜保存。 |
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