（一）原理

细胞凋亡的发生，是由于钙-镁依赖性核酸酶进入核小体间切割DNA,产生180bp～200bp或其倍数的核小体片段。而核小体由于与组蛋白H2A、H2B、H3和H4形成紧密复合物而不被核酸内切酶切割。采用双抗体夹心酶免疫法，应用小鼠抗DNA和抗组蛋白的单克隆抗体，与核小体片段形成夹心结构，可特异性检测细胞溶解物中的核小体片段。

（二）材料与试剂

1．采用BoehringerMannheim公司试剂盒，生物标记的小鼠抗组蛋白单克隆抗

体。

2．过氧化物酶（-POD）标记的小鼠抗DNA单克隆抗体

3．链霉亲合素包被的微孔板

4．DNA－组蛋白复合物，作为阴性对照。

5．ABTS底物

6．溶解缓冲液

7．温育缓冲液

8．底物缓冲液

（三）样品

1．培养细胞或离体细胞的裂解物细胞裂解步骤：收集细胞，离心后，用200µl溶细胞缓冲液重新悬浮，室温下作用30min。

2．培养细胞的上清液

3．血浆（血清）

（四）操作方法

1．取样品离心后（1000r/min,10min）,吸取20µl上清液，加入链霉亲合素包被的培养板孔中。

2．另加入80µl免疫反应试剂含抗－DNA－POD、抗组蛋白－生物素及温育缓冲液（按1︰1︰18混合），室温下孵育2h（置摇床上，250r/min）。

3．取上清，用300µl温育缓冲液洗涤3次，小心移去洗涤液。

4．加入100µl底物缓冲液，室温下孵育使颜色变化至适合（置摇床上）。

5．尽快作比色分析（10min～20min内），用底物缓冲液作空白对照，以波长405nm，参考波长492nm进行检测。

（五）结果判定

按下列公式计算细胞释放的单/低聚核小体片段的特别聚集值：

注：mU=吸收值（10^-3）=双孔吸收值的平均OD值－底物OD值，若样品的吸收值超过比色测定范围，应适当稀释后再检测。

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