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原代细胞培养服务：原代细胞分离培养鉴定以及检测等整体课题服务
 

Case：新生SD大鼠原代心房肌细胞分离与药物刺激培养冰检测相关蛋白与基因

实验设计

一、细胞：分离大鼠原代心房肌细胞

二、细胞培养分组： 
    a)对照组：正常大鼠原代心房肌细胞72h培养
    b)高糖72h培养
   c)高糖+氧化应激抑制因子72h培养
    d)正常培养48h+氧化应激刺激因子再培养24h
   e)高糖培养48h+氧化应激抑制因子再培养24h
   f)正常培养48h+（氧化应激刺激因子+氧化应激抑制因子）共同培养24h
三、蛋白检测：WB检测各组培养细胞中A蛋白与B蛋白的表达。
四、荧光定量检测：荧光定量PCR方法检测各组培养细胞中A基因与B基因的表达。

实验报告

一、新生SD大鼠心房肌细胞的分离与培养： 
    1、无菌条件下，取出1-3d龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，最后将组织剪成1mm3左右大小；
   2、往组织块中加入4mL酶消化液（0.1%胰酶和0.1%I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10%FBS培养基终止消化 后4℃放置；
    3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织完全被消化；
   4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％FBSDMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃，5％CO2培养箱中培养；
   5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；

二、新生SD大鼠心房肌细胞的α-actin免疫荧光鉴定： 
   1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；
   2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％TritonX-100透膜15min；
   3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4%BSA封闭细胞30min；
   4、按1:100的比例稀释α-actin一抗（Abbioscience公司），然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；
   5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗（嘉美生物公司），37℃条件下放置1h；
   6、用PBS冲洗3次，每次10min，最后在倒置荧光显微镜(Leica公司)下观察图像并拍照。

200×

400×

三、Real-timePCR检测SD大鼠心房肌细胞CaMK-Ⅱδ、A基因、B基因、FKBP12.6mRNA表达水平 
1、总RNA的提取： 
   （1）将细胞培养液吸出后，用PBS洗细胞2次，加入1mLTrizol室温裂解细胞5min，用移液器均匀吹下细胞并置于EP管中，上下轻柔颠倒10次，室温静置5min；
   （2）加0.2mL氯仿，颠倒混匀10次，室温静置5min，4℃，12000rpm，离心20min；
   （3）转上层水相于另一新EP管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀10次，-20℃放置2h后，4℃，12000rpm，离心15min；
   （4）用移液器小心吸弃上清，加冰预冷的75%乙醇，4℃，12000rpm，离心10min；
   （5）弃上清，EP管倒扣，空气干燥10min；
   （6）将总RNA溶于适量DEPC处理水中，最后用分光光度计测量其浓度。
2、第一链cDNA合成（Genecopoeia试剂盒） 
   （1）反应体系（20μL）： 
   TotalRNA 2μg
   Oligo(dT)18 1μL
   10mMdNTPs 1μL
   5×RTBuffer 4μL
   RibonucleaseInhibitor 0.5μL
   TransScriptRT 1μL
   ddH2Otofinalvolume 20μL   

   （2）轻轻混匀后，进行： 
   a)42℃孵育30min.
   b)85℃孵育5min.
   c)-20℃，保存备用.
3、Real-timePCR（GenecopoeiaSYBRGreenI荧光染料试剂盒） 
  （1）引物序列： 
   a、CaMK-ⅡδF：CTGGCACACCTGGGTATCTT
     CaMK-ⅡδR：ATCCCAGAAGGGTGGGTATC
   b、AGeneF：TAACCTACCAGGCCGTGGAT
     AGeneR：GCTGCGATCTGGATAAGTTCAA
   c、BGeneF：GCAGTTGACTGAGGCGTCTT
     BGeneR：GGATTCGTGAGTGGCGATAC
   d、FKBP12.6F：CTGGAATTCATGGGCGTGGAGATCGAG
     FKBP12.6R：GACTCGAGTCACTCTAAGTTGAGCAGCTC
   e、β-actinF：GACGGTCAGGTCATCACTATCG
      β-actinR：ACGGATGTCAACGTCACACTTC
   （2）反应体系（25μL）： 
   F引物 0.5μL
   R引物 0.5μL
   SuperMix 12.5μL
   PassiveReferenceDye 0.5μL
   cDNA 2μL
   ddH2O 9μL
   （3）程序设置如下（EppendorfPCR仪）： 
   95℃      3min
   95℃      20s
   55℃      20s         40循环
   72℃      20s
   95℃      15s
   60℃      15s
   60℃-95℃ 20min
   95℃      15s
   （4）Realplex软件导出数据并分析

CAMK-II基因

A基因

B基因

FKBP12.6基因

四、WB检测新生SD大鼠心房肌细胞CaMK-Ⅱδ、A蛋白、B蛋白、FKBP12.6蛋白表达水平
1、实验材料 
   PBS、细胞裂解液、PMSF、BCA试剂盒（嘉美生物）、5×蛋白上样缓冲液、脱脂奶粉，CaMK-Ⅱδ一抗（Abbioscience）、B蛋白一抗（Abbioscience）、FKBP12.6一抗（Abbioscience）、β-actin一抗（Abbioscience）和B蛋白一抗(Millipore)、山羊抗兔-HRP二抗(abcam)、ECLReagent（嘉美生物）、显影剂、定影剂。
2、实验仪器 
   细胞刮、1mL注射器、EP管、移液器、冷冻离心机、摇床、酶标仪、电泳器材、PVDF膜、电转器材、X光片、压片盒。
3、实验方法 
   （1）细胞裂解液配制：基础裂解液中加入0.2mmol/LPMSF蛋白酶抑制剂。
   （2）蛋白样品制备： 
       ①弃去六孔板细胞中的培养基。
       ②每孔细胞中加入2mL4℃预冷的PBS，平放轻轻摇动2min洗涤细胞，然后弃去PBS洗液。重复以上操作。
       ③每孔加入100μL细胞裂解液在冰上对细胞进行裂解，然后用细胞刮将细胞刮下，最后将裂解液移入干净的EP管中。
       ④将EP管中细胞冰上裂解30min，在此期间用1mL注射器对裂解液进行反复抽吸20次。
       ⑤裂解完后，于4℃，12000rpm离心20min。然后将上清移入新的1.5mLEP管中，即为所需蛋白样品。
       ⑥每样本取3μL 蛋白提取液转入另外的EP管保存备定量用。向其余蛋白样品中加入其1/4体积的蛋白上样缓冲液，沸水煮5min，最后将其－80℃保存。
  （3）蛋白浓度测定： 
        根据嘉美生物BCA试剂盒说明书中步骤进行实验。具体步骤如下：
       ①将0.5μg/μL蛋白标准品按0、1、2、4、8、12、16ul加到96孔板中，然后将各孔用细胞裂解液补足到20μL。
       ②每样品加2μL到96孔板的样品孔中，然后将各孔补加18μL的细胞裂解液。
       ③各孔加人200μLBCA工作液（BCA试剂A:BCA试剂B=50:1），37℃条件下放置30min。
       ④用酶标仪测定562nm波长处各孔的吸光度。最后根据标准曲线计算蛋白浓度。实验结果见后面结果部分内容。
   （4）SDS-PAGE电泳： 
       ①配胶：CaMK-Ⅱδ（1.5mm10%分离胶,5%浓缩胶）、A蛋白、B蛋白（1.5mm5%分离胶，4%浓缩胶）、FKBP12.6（1.5mm15%分离胶，5%浓缩胶）
       ②上样：取制备好的蛋白样品，使用前沸水煮5min，12000rpm离心2min。各样本之间平衡后，每泳道上样45μL。
       ③电泳：浓缩胶60V，分离胶100V，溴酚蓝移动至玻璃板底端，提示电泳结束，关闭电源。
   （5）转膜： 
       ①将PVDF膜放到甲醇中浸泡2min，然后把转膜海绵垫、滤纸、PVDF膜放置于电转液中平衡30min。
       ②将转膜夹打开，在代表负极的黑色面铺上一块湿润的海绵垫，再添加2层湿润的滤纸，将电泳好的SDS-PAGE分离胶小心地铺在滤纸上方，表面再覆盖大小合适的PVDF膜；然后再覆盖两层湿润 滤纸，再垫上湿润的海绵垫，最后将转膜夹的红色面与黑色面闭合好，将其放入转膜槽中相应的位置。
       ③转膜CaMK-Ⅱδ（100V，60min）；A蛋白、B蛋白（100V，180min）；FKBP12.6（80V，30min），转膜全过程在冰上进行。
       ④丽春红染色：转膜完成后，将膜从转膜夹中取出，立即投入丽春红染液中染色，大约染色3min后将膜从丽春红染液中取出，用DDH2O轻轻冲洗膜，注意观察膜上的红色条带，当条带足够清 晰后停止水洗，根据蛋白Marker位置适当剪膜，留出目的蛋白所在的范围。最后用DDH2O彻底洗膜，尽可能洗去残留的丽春红染料。
   （6）封闭：室温条件下，5%脱脂奶粉+TBST在摇床上封闭1h。
   （7）一抗杂交： 
       CaMK-Ⅱδ（1:500）、A蛋白（1:200）、B蛋白（1:50）、FKBP12.6（1:300）、β-actin（1:1000），4℃孵育过夜。
   （8）洗膜：TBST洗膜3次，每次10min。
   （9）二抗杂交：山羊抗兔-HRP二抗（1:2500），室温孵育1h。
   （10）洗膜：TBST洗膜3次，每次10min。
   （11）显影： 
        首先，用滤纸吸去膜上的液体，将膜平放于保鲜膜上，将新鲜配置好的ECLReagent滴加到膜面上，反应3min后用滤纸在膜的边缘尽量吸去多余的ECLReagent，然后根据条带的亮度将膜放到 压片夹中曝光适当的时间，最后，显影、定影、冲洗胶片及对胶片进行扫描分析。

BCA试剂盒蛋白定量实验结果：
标准品OD值分别为：0.488、0.519、0.559、0.603、0.668、0.759、0.884
LG组、NG组、HG组、HG+U组OD值分别为：0.646、0.677、0.671、0.698
ONOO组、DC-ONOO组、ONOO+U组OD值分别为：0.816、0.703、0.79、0.612

WB实验结果：