1)训练目的

了解鸡胚的发育过程；掌握鸡胚原代细胞制备及培养技术。

2)实验材料

①试剂：Hank’s液、含10％～20％血清的细胞培养液、碘酊棉、酒精棉、0．25％胰酶。

②器材：超净工作台或生物安全柜、细胞培养瓶、洗耳球、灭菌吸管、平皿、毛细吸管、离心管、剪刀、小镊子、CO2培养箱、倒置显微镜。

3)操作步骤

(1)鸡胚的孵育

受精鸡胚放在蛋托上，大头朝上，放人温箱培养。在温箱底部放上一盘水，温度调至37．8℃。

(2)鸡胚的发育过程

①观察方法：将9～12d的鸡胚取出，放人平皿中进行观察。

②鸡胚的发育：采用鸡胚进行细胞培养时，应对鸡胚的发育有一个初步了解。鸡胚的发育是由受精卵开始的。它在通过输卵管时，已开始分裂，当产卵时已在卵黄上部形成一层细孢，称为胚盘，在适宜的条件下胚盘继续分裂生长。在发育过程中从卵黄和卵白中获取养料和水分．由于胚体和卵黄分开的缘故，胚胎只通过卵黄带与卵黄相连。发育的早期形成3个胚层，即外胚层、中胚层和内胚层，由此形成的胚胎的各个器官和组织。一般孵育至3d出现尿囊，为直肠侧部分的膨出物，尿囊膜是由内胚层和中胚层构成的。至第4～5d胚体出现羊膜、尿囊膜及绒毛膜层包被。羊膜系由外胚层和中胚层组成，开始时紧贴于胚体上，后来腔内逐渐充满羊水。尿囊膜在生长发育的过程中，与绒毛膜相连而成绒毛尿囊膜，此膜由三层细胞组成：外层为外胚层，内层为内胚层，中间为中胚层，其中有很多血管，有两条主动脉自卵黄囊延伸到此膜中，与此并行有两条主静脉，汇成一较大的尿囊静脉。绒毛尿囊膜是鸡胚的呼吸器官，位于壳膜之内。此膜生长发育很快，第10d已包围了整个鸡胚，此时鸡胚已出现羽毛，呼吸道的发育在第12～15d出现。胚胎体积逐渐增大时，胚胎腔外体液El趋减少，孵出小鸡时已无胚胎腔外体液。在发育早期，尿囊液及羊水的成分与生理盐水溶液相差无几，12d后羊水的蛋白含量及黏稠度增加，尿囊腔积累了肾脏的排泄物，因此，在12d或13d后，尿囊液由于尿酸盐的存在，使原来透明的液体呈现混浊。尿囊液的酸碱度在7—12d期间呈弱碱性，在孵育的末期为pH6．O。6～13d鸡胚羊水的平均量为5—10mL，至13d有时可达lOmL。卵白的水分在发育的zui初7d中转移到卵黄囊内，在第16d卵白转入羊水腔为胚胎所吞食。卵黄在发育时逐渐被一层细胞包围，自12d以后卵黄逐渐干燥，在孵出之后24～48h，整个卵黄囊被吸入小鸡腹腔内，供雏鸡出生后zui初几天的营养。

(3)鸡胚原代的细胞培养

①消毒：选9～12d的鸡胚2—3个放入超净工作台中，大头(气室)朝上放置，先用碘酊棉，消毒气室部位。

②取鸡胚：用镊子剥去头、四肢及内脏，洗2—3次，用Hank's液洗去红细胞，吸去液体。

③剪碎鸡胚及清洗：用小剪刀将鸡胚反复剪碎成泥状，加Hank's液，吸入细胞培养瓶，稍静置，让组织下沉，吸去液体。用Hank's液洗2～3次，吸去液体，以去除红细胞等。

④加胰酶：根据组织的多少加入一定量的O．25％胰酶，胰酶的量以将组织块浸泡在胰酶中为适中，一个鸡胚一般加0．25％的胰酶4～5mL。

⑤消化：用胶塞封紧，轻摇均匀，置4℃冰箱静置过夜或37℃水浴消化1h。

⑥洗去胰酶：消化完毕后，吸出胰酶，用Hank's液或PBS洗3次以洗去胰酶，吸去洗液后。洗时注意轻摇，如猛烈摇动，会将组织块摇散，吸去洗液后，用营养液将细胞洗出，放入培养瓶。

⑦计数培养：加入适量的完全培养液(10～20mL)，用吸管反复吹打形成细胞悬液，用细胞计数法，计算每mL营养液中的细胞数，根据所计算的细胞数，将原液稀释成106个／mL。将稀释好的细胞悬液接种到培养瓶中，一般200mL培养瓶，放15—20mL培养液，节约时可放lOmL培养液，培养液的量以覆盖瓶底为适中。

⑧放入37℃、5％CO2温箱培养：培养时，培养瓶的盖不要拧得太紧，以不会下掉为度，以便CO2进入。培养1～2d后长成单层细胞，即可应用。

4)注意事项

①全部操作过程应在无菌条件下完成。

②故人5％CO2温箱培养的目的是5％CO2能调节培养瓶中的pH，使之在一个星期或更长时间pH保持不变。