主要试剂、实验鼠

RPMI1640

培养液、胎牛血清、Ⅰ型胶原酶均购自美国

GIBCO

公司；青霉素

为石家庄制药集团有限公司产品；

链霉素为华北制药股份有限公司产品；

胰蛋白

酶为

Sigma

公司产品。

SCIDBalb/c

小鼠，雌性

7

周龄，体重（

20±

2

）

mg

，购

自中科院上海实验动物中心。

1.

细胞培养及建系手术：

切除肿瘤后，

立即用刀片切开瘤块，

在其中心取数个直径约

0.5cm

的组织块

（尽

量避开血管）后装入双抗培养基中带入实验室，标本用

D-Hanks

液洗涤

2

次，

将组织块放入培养皿中，加入

0.1%

胶原酶

1

mL

后

,

用眼科剪将组织块剪成

2

mm

碎块，

再加入

5mL

胶原酶混合；

用吸管吹打

50

次，

置

37

℃水浴箱或培养箱内，

20min

摇晃

1

次；

1h

后取出，

用吸管吹打

20

次，

1000r/min

离心；弃去上

清液，加入

5mL

培养液终止消化，吹打

20

次后，用

200

目尼龙筛网过滤，如浓

稠，再加入少量培养液冲洗；将冲洗液

1000r/min

离心

5min

，弃去上清液，再

加入

4

mL

培养液（含

20

％胎牛血清、

100

U/mL

青霉素和

100

U/mL

链霉素的

RPMI1640

培养液），

置入

37

℃、

5%CO2

培养箱内，

24h

后换液

1

次，以后

每

2

天换液

1

次，

用

0.25%

胰酶消化，

差速贴壁纯化后传代培养，

每周传代

2

～

3

次，

取不同代数的细胞冻存于－

196

℃液氮中保存，同时进行细胞生物学特性分析。

2.

细胞形态学观察：相差显微镜观察体外培养细胞的生长状态与生长方式。

3.

细胞爬片及免疫组化鉴定：准备

6

孔细胞培养板，载玻片多聚赖氨酸

PLL

包

被，

培养板每孔中加

1

滴培养基，

然后将玻片置于液滴上压紧，

取第

10

代细胞

常规细胞消化、离心、重悬，按

1×

106

／

mL

的密度将吹打的细胞悬液分别加

到每个孔载玻片上，

让其贴壁生长

72h

后，

吸出培养液，

用

PBS

冲洗

2

遍，

4

％

的多聚甲醛固定

20min

，

在用

PBS

洗

2

遍后，

行免疫组化染色

（

CD117

、

CD34

）

及

HE

染色。用镊子小心将爬片取出，细胞面朝向载玻片，用中性树胶封片、照

相。

4.

成瘤性检测及成瘤组织

DNA

测序：取第

10

代细胞，用胰酶消化后，

用无血

清培养基制成密度为

1.0×

107/mL

的单细胞悬液，取

10

只

SCIDBalb/c

小鼠，每

只鼠腋部皮下注射

0.25mL

细胞悬液，

无菌条件下喂养，

5

～

6d

即可在注射部

位扪及米粒大小的瘤结节，

成瘤率

100%

，

接种后

20d

瘤块增大，

直径约

1

～

2cm

，