原代培养后由于细胞游出数量增加和细胞的增殖，单层培养细胞相互汇合，整个瓶底逐渐被细胞覆盖。这时需要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或密度过大，营养障碍，影响细胞生长。细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程称之为传代；进行一次分离再培养称之为传一代。初代培养的首次传代是很重要，是建立细胞系关键的时期。在首次传代时一般要特别注意以下几点：

（1）细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面以前，不要急于传代。

（2）原代培养时细胞多为混杂生长，上皮样细胞和成纤维样细胞并存的情况很多见，传代时不同的细胞有不同的消化时间，因而要根据需要注意观察及时进行处理。并可根据不同细胞对胰蛋白酶的不同耐受时间而分离和纯化所需要的细胞。另外，早期传代的培养细胞较已经建系的培养消化时间相对较长。吹打细胞时动作要轻巧尽可能减少对细胞的损伤。

（3）首次传代时细胞接种数量要多一些，使细胞能尽快适应新环境而利于细胞生存和增殖。随消化分离而脱落的组织也可一并传入新的培养瓶。

 

细胞传代方法

A.【概述】

培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。贴壁生长的细胞用消化法传代；部分贴壁生长的细胞用直接吹打即可传代；悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打传代。
 

B.【用品】

（1）0.25%胰蛋白酶或其它消化液，培养液，Hanks液

（2）滴管，离心管，培养瓶（皿），培养瓶盖，注射器，计数板，橡皮乳头

C.【步骤】
（1）贴壁细胞的消化法传代

①吸除或倒掉瓶内旧培养液。

②以25ml培养瓶为例，向瓶内加入1ml消化液（胰蛋白酶或与EDTA混合液）轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面，然后吸掉或倒掉消化液后再加1～2ml新的消化液，轻轻摇动后再倒掉大部分消化液，仅留少许进行消化。也可不采用上述步骤，直接加消化液进行消化。

③消化最好在37℃或室温25℃以上环境下进行。消化2～5min后把培养瓶放置显微镜下进行观察，发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即终止消化。

④吸除或倒掉消化液，如用EDTA消化，后加Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶把残留消化液冲掉，然后再加培养液。如仅用胰蛋白酶可直接加少许含血清的培养液，终止消化。

⑤用弯头吸管，吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，吹打过程要顺序进行，从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有底部都被吹到。吹打时动作要轻柔不要用力过猛同时尽可能不要出现泡沫，这些都对细胞有损伤。细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。

⑥计数，分别接种在新的培养瓶内。

小鼠肝细胞的原代培养1

（2）悬浮细胞的传代

因悬浮生长细胞不贴壁，故传代时不必采用酶消化方法，而可直接传代或离心收集细胞后传代。

直接传代即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清吸掉1/2～2/3，然后用吸管吹打形成细胞悬液后，再传代。

悬浮细胞多采用离心方法传代，即将细胞连同培养液一并转移到离心管内，离心800～1OOOrpm，5min，然后去除上清，加新的培养液到离心管内，用吸管吹打使之形成细胞悬液，然后传代接种。

部分贴壁生长细胞，不经消化处理直接吹打也可使细胞从壁上脱落下来，而进行传代。但这种方法仅限于部分贴壁不牢的细胞，如Hela细胞等。直接吹打对细胞损伤较大，细胞也常有较大数量丢失，因而绝大部分贴壁生长的细胞均需消化后，才能吹打传代。

小鼠肝细胞的原代培养2
（以上节选自《细胞培养》主编司徒镇强吴军正）
 

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