SMMC-7721SMMC-7721细胞细胞株培养

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基因敲除技术是20世纪80年代发展起来的，是建立在基因同源重组技术基础以及胚胎干细胞技术基础上的一种新分子生物学技术。基因敲除就是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的的一种技术。本文对三种基因敲除技术作比较，描述它们的优缺点。

基于胚胎干细胞的同源重组技术

1、优势：成熟、可靠、精细是目前为止唯一一个可以满足所有要求的打靶技术

2、局限性：

A需要ES细胞，目前只有小鼠有高效的ES细胞，其它模式动物的ESC还不能实现大规模应用。

B周期长、工作量大、费用相对比较高

3、可提供服务类型：

A全基因敲除模式小鼠

B条件性基因敲除模式小鼠

C先全敲除再条件性敲除模式小鼠

D基因敲入模式小鼠

EROSA位点定点转基因

TALEN技术

1、优势：基因敲除效率高，速度快，可实现多物种基因敲除

2、局限性：

基因敲入效率较低，多基因敲除困难，系统构建相对复杂，存在脱靶风险

3、可提供服务类型：

A全基因敲除大/小鼠

B全基因敲除细胞系

EGE系统

1、优势：基因敲除/敲入效率高，速度快，可实现多基因、多物种基因敲除/敲入，系统构建简单

2、局限性：

存在脱靶风险，但通过选择合适的sgRNA可以有效降低脱靶率，Invivo脱靶可通过传代去除.

3、可提供服务类型：

A全基因/条件性基因敲除大/小鼠

B全基因/条件性报告基因敲除/敲入大/小鼠

CCRISPR/Cas9粒构建

D细胞系敲除/敲入

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研究人员在细胞培养时出现存活率不佳，常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。胎牛血清使用错误或胎牛血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于–80℃太久。

研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少，大都是因为离心过程操作上的失误，造成细胞的物理性损伤，以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心，应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。

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SMMC-7721SMMC-7721细胞细胞株培养快速识别与处理常见细胞污染的招术：

1、细菌：

识别：细菌在显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，有球形，链形，杆形等。大家不必深究。只要发现培养液浑浊变黄，培养瓶顶部有一层细沙一样的东西。就知道大事不好啦。

处理：可在培养液中加相应的抗生素处理。可以用四环素，庆大霉素，或者链霉素，前两者的工作浓度是50μg/mL;链霉素的工作浓度是100μg/mL。其实，毛毛虫说句实话，一旦发生污染，就已经大势已去了。如果细胞不是特别特别珍贵的话，还是趁早扔了，重起炉灶吧。所以，最重要的还是防范于未然。做好培养间，CO2孵箱，器皿和培养液的消毒灭菌工作。在操作的时候，严格执行无菌操作规范。

2、霉菌：

识别：因为培养液是清亮的，所以霉菌污染非常难以早期发现，等发现时往往已经为时过晚了。培养液中慢慢地出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，如同风中柳絮。细胞仍可生长，但时间一长，细胞的状态就变差。

处理：细胞一旦被霉菌污染，很难挽救，两性霉素B或制霉菌素都于事无补，建议果断舍弃该污染细胞，将环境彻底消毒。

采用酒精彻底底地擦洗一遍CO2孵箱。然后再用新洁尔灭擦洗一遍。把水盘里加上饱和量的硫酸铜。

3、支原体：

识别：多为多边形，培养液一般会变浑浊。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是和你一起慢慢变老。支原体污染后，可影响所有的细胞生长参数。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。

处理：没有什么好处理的。直接扔了吧。污染到其他的细胞就亏大发了。还是那句话，预防为主。

4、黑蛟虫：

识别：谁都不知道所谓的“黑胶虫”是什么东西。据说是纳米级的细菌。低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去。培养液也是不浑的，一般不会太影响。但是如果太多了，也会影响细胞生长和实验结果。

处理：因为根本不知道这是什么物种，所以也谈不上什么处理方式。建议如果细胞有可能是此种污染的话，可以增加细胞的种板密度，以提高细胞的生存率。

5、真菌：

识别：真菌污染和霉菌污染差不多。一般培养液清亮，所以很难早期发现。镜下有时候象丝状，有时候象珊瑚状。慢慢地会长出很细的黑色丝状物。这个时候，已经晚了，细胞很难救活了。

处理：同霉菌污染一样，没有什么好处理的，直接扔了吧。然后彻底消毒灭菌培养间，CO2孵箱，器皿和培养液。