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TopoGEN在体内拓扑异构酶抑制试验方面具有丰富的经验。这些实验使研究者可以确定新型试剂是否对核的染色体环境中的内源性拓扑有活性。该分析的一个重要好处是，可以使用任何肿瘤细胞或组织来建立测试药物针对特定肿瘤细胞系的临床功效。对于Topo I，我们使用与Topo II基本相同的基本方法。该方法基于从游离DNA物理分离topo / DNA加合物，并使用抗体测量结合的topo I或II。在该分析中，用测试化合物以及阴性对照（无药物）和阳性对照（已知抑制剂）处理组织培养细胞。细胞经过药物处理，并用Sarkosyl迅速裂解，Sarkosyl在共价裂解复合物中捕获DNA内源性拓扑的一部分。去污剂裂解后，将裂解液稀释以完全解离非共价DNA /蛋白质复合物。共价拓扑/ DNA复合物在CsCl梯度上分离（5 M CsCl也可防止离子DNA /蛋白质相互作用）。该梯度分别解析DNA，染色质聚集体和蛋白质。将梯度离心过夜并分级。与DNA峰一致的topo量是共价DNA /拓扑复合物的量度。通过使用topo I或II抗体作为探针，通过免疫印迹测定DNA峰中的拓扑浓度。在没有能稳定可裂解复合物（依托泊苷，喜树碱）的药物的情况下，在DNA峰中只能发现低水平的topo。这对于topo II尤其明显，因为除非使用抑制剂，否则II型酶不会被该方法捕获。相反，即使在没有喜树碱的情况下，topo I的捕获程度也很低。在DNA密度和蛋白质密度下，topo的比率反映了可裂解复合物稳定的相对效率。

套件内容：

-喜树碱（用TG1021 Top1冻干提供）-
依托泊苷（用TG1022 Top2冻干提供）-
沙古糖基（20％）
-拓扑异构酶I的抗体（TG1021 Top1提供）
-拓扑异构酶II的抗体（170kDa形式，由TG提供）
-CsCl储备溶液-
详细说明手册

一般程序：
该方法的概要如下所示。待测试的细胞可以是特定的细胞系，病毒感染的细胞或肿瘤组织。在有利于内源性拓扑活性的条件下培养细胞（定义为有助于细胞生长的生理条件）；因此，内源酶在一系列断裂和重新密封步骤中与DNA模板结合。同时，诸如DNA复制，转录和修复的中心遗传过程正在进行中。然后将细胞用去污剂（Sarkosyl）迅速溶解。重要的是，在将细胞保持在37°C的同时进行裂解；如果在裂解之前先冷却或处理细胞，裂解复合物往往会重新连接并产生阴性结果（见Trask和Muller，1988）。下一步需要从游离蛋白质中纯化DNA。然而，必须避免有机提取或蛋白酶消化。为此，我们使用了阶梯式CsCl梯度。密度步骤旨在从游离蛋白质中分离DNA，并且可以定量回收两者。包含拓扑和DNA的共价复合物沉淀到DNA的位置。众所周知，共价结合的蛋白质可以改变CsCl中DNA的密度，并且密度变化的幅度与蛋白质的总量成正比。在体外，topo I在蛋白质化学计量过量的条件下可能会产生DNA的密度变化（数据未显示）；然而，体内与蛋白质偶联的蛋白质明显更少。实际上，由于以下两个原因，DNA拓扑异构酶在该分析中不会引起基因组DNA的任何密度变化（见下文）。第一，每个DNA分子结合的拓扑蛋白的数量非常低，在这些梯度中，复合物的行为就像游离的DNA（相对于DNA /蛋白质加合物）。其次，梯度非常陡峭，无论如何都无法解决小的密度差异。CsCl离心后，将梯度分级，并使用狭缝或斑点印迹以及TopoGEN开发的抗体通过Western印迹法测量结合和游离topo的量。结合/游离的比率是特定细胞系统中可裂解复合物形成的直接量度。我们发现，在没有抑制剂的情况下，拓扑异构酶很难（如果不是不可能）以可裂解的复合物的形式被捕获在细胞内。因此，任何导致在DNA峰中检测到topo I或II的测试化合物（见下文）最有可能是topo活性剂。然后，体内连接试剂盒使研究者可以评估化合物在不同组织环境中或感染病毒的细胞中对topo I和II的活性。最后，可以在同一实验中结合对topo I和II的分析。在这种情况下，可以使用拓扑异构酶I或拓扑异构酶II的抗体评估拓扑异构酶I的抑制作用。某些药物可能对两种酶都起作用（Trask和Muller，1988）。

人类拓扑异构酶IIα单克隆抗体：免疫印迹和免疫组化试剂
制备了针对源自p170 kDa人Topo IIa C端的寡肽的单克隆抗体。然后在含有相同肽的柱子上亲和纯化抗体。亲和纯化的抗体可用于探测Western印迹，前提是包括对照以清楚地标记170 kDa topo II的位置。原因是在常规提取和操作过程中人topo II很容易降解或被蛋白水解。结果，可以检测子带。一些实验室已经报道了SDS-PAGE模式的异质性（Shelton等，1983; Halligan等，1985; Muller等，1988），最近还报道了粟酒裂殖酵母拓扑异构酶II的蛋白水解产物（Shiozaki和Yanagida，1991年）。因此，如果存在广泛的蛋白水解，抗体可能看起来是非特异性的。TG2011-3），其对应于完整的170kDa拓扑异构酶II。报道了编码汉拓扑异构酶II的第二个基因（拓扑II-β或180kDa形式）（Chung等，1989； Tan等，1992）。该抗体与topo II的170 kDa亚型特异性反应。

单克隆抗体单位定义：
抗体浓度以蛋白质印迹单位为单位；一个单位对应于制备常规蛋白质印迹稀释探针所需的抗体的1：1000稀释度。因此，10个单位的抗体将制成10 ml稀释的探针（直接添加到单个印迹中）。

盐酸拓扑替康（Hycamtin）说明
Hycamtin（盐酸拓扑替康）是喜树碱的半合成衍生物，是靶向topo I的抗肿瘤药物，是topo I的毒物（诱导裂解复合物）。 

化学名称：（S）-10-[（（二甲基氨基）甲基] -4-乙基-4,9-二羟基-1H-吡喃并[3'，4'：6,7]吲哚并[1-2，b]喹啉- 3,14-（4H，12H）-二酮一盐酸盐

分子式： C23H23N3O5•HCl

分子量： 457.9

盐酸托泊替康盐酸盐可溶于水，并在213°至218°C时分解分解。TopoGEN提供此试剂作为拓扑异构酶I的对照毒物/抑制剂。对于体外裂解检测，我们建议您在很宽的uM浓度范围内测试该药物；但是，裂解反应受拓扑异构酶的量以及所用测定的类型的强烈影响（SDSK +对比放射性末端标记的DNA对比测试质粒的裂解）。注意，与测量催化活性的测定相比，检测裂解复合物将需要大量的酶。

样品瓶内容：
TG4100已悬浮在10 mM（0.25 ml）的水中，可以使用了。该药物经过了预先测试，并显示可使用来自TopoGEN的纯化的人类拓扑异构酶诱导拓扑分裂。

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