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제품특징
□ 특징
● Cell-derivednanovesicle(Gesicle)을 이용하여 Cas9/sgRNA ribonucleoprotein(RNP)를 세포 내 직접 도입
● Broadtropism: 다양한 Cell line에 적용 가능
● Hard-to-transfectioncell line (분열세포, 비분열세포, iPS 세포)에서도 효율적인 CRISPR/Cas9 Genome Editing 가능
● Off-targeteffect 최소화: 도입된 Cas9/sgRNA Complex는 세포 내에서 신속하게 제거되어 Off-target effect를 줄일 수 있음
□ 제품설명
Guide-itCRISPR/Cas9 Gesicle Production system은 Cas9/sgRNA Complex를 세포에 효율적으로 도입하기 위한Cas9/sgRNA Gesicle을 제작하는 제품이다. Cas9/sgRNA Gesicle을이용하면 Plasmid transfection이나 Virus transduction을이용한 Genome Editing과 비교하여 더욱 다양한 세포주에 효율적으로 Cas9/sgRNA ribonucleoprotein (RNP)를 도입할 수 있다. 본 시스템에서는 target DNA specific-sgRNA를 발현하는 CRISRP/Cas9plasmid를 Gesicle 제작용 세포인Gesicle Producer 293T Cell Line (Code 632617)에transfection하여 Cas9/sgRNA Gesicle을 제작한다. Cas9/sgRNA Gescle 생성에 필요한 시약은 2개의튜브에 동결건조 상태로 제공되며, sgRNA를 클로닝한pGuide-it sgRNA1 Vector를 튜브에 첨가 후, 혼합물을 Gesicle Producer 293T Cell Line에transfection함으로써 간단하게 Cas9/sgRNA Gesicle을 제작할 수 있다.
□ CRISPR/Cas9 Gesicle의 원리
Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle ProductionSystem은 고농도의 Cas9/sgRNA를포함한 Gesicle을 제작한다. Gesicle에는 Cas9 단백질, target specific sgRNA,CherryPicker Red Fluorosence protein, Glycoprotein으로 구성되어있다. ① sgRNA 서열을 삽입한 pGuide-it-sgRNA1 vector를 Gesicle PackagingMix1과 Mix2를 이용하여 GesicleProducer 293T Cell Line에 transfection하면 Gesicle Producer 293T Cell membrane에Glycoprotein이 생성된다. ② 이 때, iDimerize 기술에 의하여Cas9단백질/sgRNA complex와CherryPicker 형광단백질이 Gesicle내에서 상호작용하게 되며, Gesicle 내로 봉입, 세포 외로 방출된다. ③ 배양액으로부터 회수한 Geiscle을 목적세포에 첨가하면 Gesicle이 세포막과 융합되어 Cas9/sgRNA Complex가목적세로 내부로 방출된다. ④ NLS Tagging에 의하여Cas9/sgRNA Complex는 목적세포의 핵 내부로 이동하며, 핵 내에서 Genome DNA의 target gene을 절단한다. 이 때, Gesicle에 포함되어있는 CherryPicker 형광단백질로 Cas9/sgRNA complex의세포 내 도입을 모니터링할 수 있다.
그림 1. Cas9/sgRNA Gesicle의 제작과 세포 내 도입 원리 
그림 2. Cas9/sgRNA Gesicle에 의한 다양한 세포의 Knock-out 효율Cas9/sgRNA Gesicle을 이용하여 각 세포주에서 Zs-Green1을 Knock-out하였다. ZsGreen1 형광단백질을 목적으로 제작된 Cas9/sgRNA Gesicle 처리 (각각 10ul, 20ul, 30ul 첨가) 또는 CRISPR/Cas9 plasmid transfection하여 Knock-out 효율을 비교하였다. Cas9/sgRNA Gesicle을 이용할 경우 transfection 효율이 낮은 세포에 대하여 일정한 제거 효율을 얻을 수 있었다.
그림 3. Cas9-sgRNA gesicle을 사용한 endogenous protein(CD81) Knock-out
그림 4. hiPS 세포에서의 CD81 Knock-outHuman CD81을 타겟으로 디자인된 Cas9-sgRNA complex를포함한 Gesicles를 회수 후, Cellartis human iPS cell line 18(ChiPSC18) Kit (Code Y00305)에 처리하고 Cellartis DEF-CS Culture System(Code Y30010) 존재 하에 각각 6시간,24시간동안 배양하였다. 그 후,Gesicle-free DEF-CS culture media로 배지 교환하여 7일간 추가배양하였다. Gesicle-treated cell과 untreated(control) cell의 CD81 발현율을 CD81을타겟하는 FITC-labeled antibodies를 이용하여flowcytometry로 측정하였다. Panel A. DEF-hiPSC ChiPSC18 cell의 CD81 negative(왼쪽) control과 positive(오른쪽) control. Panel B. Gesicle 처리 6시간(왼쪽), 24시간 (오른쪽) 후, DEF-hiPSCChiPSC18 cell의 CD81 발현율
□ 적용
● CRISPR/Cas9-mediatedgene editing
● Stem cell research
□ 구성품
| Guide-itCRISPR/Cas9 Gesicle Production System (Code 632613) | ||
| 1. | Guide-itCRISPR/Cas9 Gesicle Packaging Set (Code 632616) | |
Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle Packaging Mix 1(greencap)Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle Packaging Mix 2(yellow cap)A/C Heterodimerizer(500 nM in Ethanol)Protamine Sulfate(4 mg/ml) | 10 vials10 vials50μ l200μ l | |
2. | Guide-itsgRNA Vector System (Code 632612) | |
a. pGuide-it-sgRNA1 Vector(Linear)(7.5 ng/μ l) | 12μ l | |
b. Guide-it Ligation Components v2 | ||
DNA Ligation Mighty MixGuide-it Oligo Annealing BufferGuide-it Control Annealed Oligos v2(100 fmol/μ l)Guide-it Sequencing Primer 1(100 pmol/μ l)PCR-Grade Water | 50μ l1.5 ml10μ l10μ l1 ml | |
c. Stellar Competent Cells (Code 636763) | ||
Stellar Competent Cells(100μ l/tube)SOC Medium(1 ml/tube)pUC19 Vector(0.1 ng/μ l) | 10 tubes10 tubes10μ l | |
| GesicleProducer 293T Cell Line (Code 632617) | ||
Gesicle Producer 293T Cell Line | 1 ml | |
□ 보존
Stellar Competent Cells:-80℃기타: -20℃
