超纯去内毒素质粒DNA大量纯化试剂盒相关交流-蚂蚁淘在线

超纯去内毒素质粒纯化试剂盒-大量【Plus】旨在采用50mL的大抽式改良型复层柱式硅胶树枝技术将质粒从细菌中提取并纯化。由于使用50mL低速离心（4000-5000rpm），因此通用性极其广泛。通常所得质粒0.1-0.3mg，OD260/OD280约1.8-2.0。使用先进的ETH和ETW试剂，可得到0.025-0.1EU/ugDNA的高纯度质粒，在转染过程中对受体细胞没有任何毒副作用，转染效率极高。抽提出来的质粒可用于PCR反应，测序，酶切反应，转化，以及细胞转染，体外转录和翻译用途。

试剂盒内容

SpinColumns52(KG205-5T)	SpinColumns102(KG205-10T)	SpinColumns202(KG205-20T)
S1Solution55mL	S1Solution110mL	S1Solution110mL*2
S2Solution55mL	S2Solution110mL	S2Solution110mL*2
S3Solution80mL	S3Solution80mL*2	S3Solution80mL*4
ETHSolution2mL	ETHSolution2mL*2	ETHSolution2mL*4
BBSolution90mL	BBSolution90mL*2	BBSolution90mL*4
BLSolution110mL	BLSolution110mL*2	BLSolution110mL*2
ETWSolution# 66mL	ETWSolution# 66mL*2	ETWSolution# 66mL*4
WBSolution# 20mL*2	WBSolution# 20mL*4	WBSolution# 20mL*8
EtEBSolution50mL	EtEBSolution100mL	EtEBSolution100mL*2
RNaseA*500μL	RNaseA*1000μL	RNaseA1000μL2
50mLTube52	50mLTube102	50mLTube202
#请在试剂瓶中加入相应的试剂。

准备工作

请仔细阅读下列操作程序。
按标签提示在WB缓冲液中加入无水乙醇，混匀，并做好标记。盖紧瓶盖保存（分别加入80mL*2，80mL*4，80mL*8至PK414,PK415,PK416的WB中）。
按标签提示在ETW缓冲液中加入异丙醇，混匀，并做好标记。盖紧瓶盖保存（分别加入44mL，44mL*2，44mL*4至PK414,PK415,PK416的ETW中）。
在S1液中加入随附的RNaseA至终浓度为10μg/ml，混匀。储存于4℃,可保存4-6个月。
ETH液必须放置在4℃冰箱。
单次试验请准备好无菌操作台，4支额外的无内毒素50mL试管，无内毒素的枪头、移液器、移液管，以及桌上离心机。

注意事项

除了ETH液外，试剂如果置于冰箱保存，使用前必须使其温度达到室温。
温度较低时，S2和S3可能会有沉淀产生。使用前必须检查一遍。如有沉淀，37℃水浴加热溶解，混匀后使用。
S2请勿过分剧烈混匀，否则会产生大量气泡。
S2有强碱性，S2和S3对人体都有刺激性，操作时请小心，并注意适当防护。
本试剂盒所有操作除了内毒素去除步骤需要冰浴和水浴外，均在室温进行。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性无内毒素手套操作。
确保每使用完一种试剂后，立即盖紧盖试剂瓶的瓶盖。
如果没有特别指示：离心速度为4000xg(4000-5000rpm)。
离心稳定为室温（20-25℃）。低温离心可能导致许多问题，因此不做推荐。

标准操作步骤

将两组质粒纯化柱分别放入附赠的50mL离心管内，各加入10mL缓冲液BL，离心1分钟，弃去管中液体，将柱/管放在室温下盖紧盖子，标记为A管和B管，以备使用。
取过夜菌液至50ml离心管内（未提供），4000xg离心5分钟收集细菌沉淀，弃上清液。再重复3次，每管共收集100ml过夜菌沉淀。【实际需时22’】
通常大肠杆菌宜用LB培养过夜(16小时左右)。建议4000xg室温离心5分钟，如沉淀不充分则适当延长离心时间。
每管加入10ml溶液S1，重悬细菌沉淀。确保沉淀完全散开，无可见细菌团块。【实际需时1’】
确认溶液S1中已添加了RNaseA。最高速度vortex10-20秒或更长时间，悬起沉淀。一定要充分混匀，对着光亮处观察应呈均匀的悬浊液，无明显细菌团块或絮块。如果没有vortex，可以用枪吹打沉淀使沉淀逐渐散开。
每管加入10ml溶液S2，轻轻颠倒离心管4-6次，室温放置3-5分钟，使细菌完全裂解，直到溶液澄清。【实际需时6’】
切勿vortex!!!vortex或其它剧烈操作会导致基因组DNA断裂，易导致最终所得质粒被基因组DNA污染。
每管加入14ml溶液S3，随即颠倒离心管4-6次混匀，可见白色絮状物产生。【实际需时1’】
切勿vortex!!!加入S3后速度颠倒混匀，以防形成盛况沉淀。颠倒次数也不宜过多，否则易导致最终所得质粒的质量下降。
室温离心15-20分钟。（用8000-12000xg高速离心效果更好）【实际需时22’】
长时间离心例如20分钟，会使沉淀更加紧密，更集中于管底，对于进一步提高质粒质量会有所帮助。速度较低时必须适当延长离心时间，使沉淀更加充分。
将上一步骤离心后的上清液分两次，第一次17mL加入A管的质粒纯化柱中，并4000xg离心2分钟，倒弃收集管中液体，再加入剩余的上清液（略少于17mL），离心2分钟，倒弃收集管中液体。【实际需时6’】
少量沉淀吸取对后续结果影响不大，但过多沉淀可能引起基因组DNA的污染。质粒倒入纯化柱内后可以不用等待，直接离心。倒弃收集管内的液体后，保留收集管继续使用。
在质粒纯化柱内加入10ml溶液WB（使用前请确认已经加入无水乙醇），最高速度离心2分钟，洗去杂质，倒弃收集管内液体。【实际需时3’】
最高速再离心5分钟，除去残留液体并使微量乙醇完全挥发。【实际需时6’】
注意：倒弃收集管内液体后再离心，才能彻底去除微量的溶液WB。微量的溶液ET会影响质粒的质量。
将质粒纯化柱置于50ml干净的离心管(未提供)上，加入55℃预热好4ml溶液EtEB到管内柱面上，放置2分钟。【实际需时3’】
溶液EtEB加热到50-60℃再加入有利于质粒的洗脱。EtEB加入后放置时间稍长，对于增加质粒产量会略有帮助。
最高速度离心5分钟，得到洗脱下来的DNA，弃去纯化柱（注意不是弃去液体!!!）。【实际需时6’】
加入预先4℃放置的400uL的ETH溶液到步骤10收集的液体中，颠倒旋转混匀7-10次，冰浴≥10分钟，中间每3-5分钟颠倒混匀一次。【实际需时12’】
ETH加入上述液体后，上清会变得浑浊，但是冰浴后应恢复清亮。
37℃水浴，溶液又会变为浑浊，颠倒混匀温浴20分钟。
室温最高转速离心10分钟分相。小心取出离心管。（此部也可用8000-12000xg高速离心，效果更好）【实际需时11’】
注意：离心温度低于20度时，ETH无法分相，因此必须控制好在室温温度以上离心。
将含DNA的水相转移到新的离心管（未提供），或弃油状层。【实际需时1’】
注意：此时溶液应分为水油两相，否则应重复步骤12-13。水相含DNA，油状相含内毒素。吸取时应避免吸到油相，最小水相吸取量为3mL。
在上一步所得上层水相中加入16mL的BB液后充分涡旋混匀，转入B管的吸附柱中，静置2分钟，4000xg离心2分钟，请勿倒掉收集管中的流过液，将此液体重新加入B管的吸附柱中，再次离心2分钟，倒掉废弃液。【实际需时6’】
加入10mlETW，4000xg离心2分钟，弃掉废液。【实际需时3’】
加入10ml漂洗液WB，4000xg离心2分钟，弃掉废液。【实际需时3’】
加入10ml漂洗液WB，4000xg离心2分钟，弃掉废液。【实际需时3’】
将吸附柱放回空收集管中，最高速（不能低于4000xg）离心5分钟以干燥基质膜上残。留乙醇，用无内毒素枪头吸除内圈压环和柱壁之间可能残留的乙醇，置于超净台中室温静置5分钟。
取出吸附柱，放入干净的无内毒素和DNase的离心管中（未提供），在吸附膜的中间部位加1ml的55℃预热好的EtEB。室温放置5分钟，4000xg离心5分钟。将所得液体小心再次移入吸附柱内，室温放置2分钟，4000xg离心5分钟，所得液体即含0.1-0.3mg/mL(0.25±0.05)超纯无内毒素质粒。【实际需时8’】
如果需要，可使用常规的乙醇或异丙醇沉淀进行浓缩。

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