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相互作用蛋白的捕获实验一基本实验
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| 实验材料 | 酵母菌 |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | CM培养基乙酸锂PEGTEDMSO甘油氨苄青霉素 |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 1. 为了转化文库，将约20ml含pSH18-34和pBait的酵母菌EGY48培养液接种到Glc/CM-Ura-His省却成分液体培养基中，于30℃培养过夜。 2. 将过夜培养液稀释到300ml Glc/CM-Ura-His 省却成分液体培养基中，浓度约为2×106细胞/ml（OD600≈0.10），于30℃培荞至菌密度约为1×107细胞/ml（OD600≈0.50）。 3. 室温下1000~1500g低速离心5min，收集酵母菌细胞。菌体用30ml无菌水重悬，并移至锥形离心管中。 4. 1000~1500g离心5min，弃上清，菌体用1.5mlTE/0.1mol/l乙酸锂重悬。 5. 取30个微量离心管分别加1μg的插入文库DNA的pJG4-5质粒和50μg高纯度的剪切均匀的鲑精担体DNA，其终体积要限制在10μl以下，然后分别加入50μl重悬的酵母菌液。 6. 分别加入300μl40%pEG4000/0.1mol/l乙酸锂/TE，颠倒混合直至完全混匀，于30℃温育30min。 7. 加入DMSO到终浓度10%（每管约加40μl），顛倒混匀，在42℃加热板上热休克10min。 8a. 取其中28管，每管涂布一块24cm×24cm Glc/CM-Ura-His-Trp 省却成分培养基平板，于30℃培养。 8b. 剩余的2管：毎管取涂布在24cm×24cm Glc/CM-Ura-His-Trp 省却成分培养基平板上。剩余的40μl用无菌水作1：10的分别等比稀释，再取稀释液分别涂布100mm的Glc/CM-Ura-His-Trp 省却成分培养基平板，所有平板均置于30℃培养至长出菌落为止（2~3天），一个哺乳动物细胞的文库的饱和筛选至少需要104个菌落。通过稀释后所铺的平板确定转化效率。 9. 收获转化子，将30个24cm×24cm 长有转化子的平板在4℃下放置冷却数小时，使琼脂变硬。 10. 戴上手套，使用无菌显微镜用的玻片，轻轻地从平板上将酵母菌细胞刮下来。将30个平板上刮下来的细胞收集到1个或2个50ml无菌的锥形试管中。 11. 用1体枳的无菌TE或水洗涤细胞，室温下1000~1500g离心5min，弃上清后重复洗涤1次。 12. 用1体积的甘油液重悬沉淀的酵母细胞，混合后分装成每份1ml，于-70℃冻存。 13. 复活酵母细胞时，用Gal/Raff/CM-Ura-His-Trp 省却成分培养基将1份冻存的转化酵母细胞作10倍稀释，于30℃摇床温育4h，诱导文库GAL启动子， 14. 接着用Gal/Raff/CM-Ura-His-Trp 省却成分培养基系列稀释酵母细胞（1OD600≈2×107细胞）。涂布于100mm的Gal/Raff/CM-Ura-His-Trp 营养省却成分培养基平板，于30℃培养直至长出可见的菌落力止。 15. 计算菌落数，推算出每一小份转化酵母的cfu数。 16. 为了选择阳性克隆，解冻适当量的转化酵母，按照步骤13稀释，培养，并以每平板接种106细胞的密度涂布100mm的Gal/Raff/CM-Ura-His-Trp 省却成分培养基平板。对于每个初次获得的转化子，涂布后应保证长出3~10个细胞，用Gal/Raff/CM-Ura-His-Trp-Leu 省却成分培养基稀释酵母菌，于30℃培养2~3天。 17. 待长出菌落后，小心地将菌落转至新的Gal/Raff/CM-Ura-His-Trp-Leu 省却成分培养基主平板上，较早出现的菌落一般较可能是真阳性的，于30℃培养。 18. 再从Gal/Raff/CM-Ura-His-Trp-Leu 省却成分培养基主平板上挑菌落转至100mm的Glc/CM-Ura-His-Trp 省却成分培养基主平板上，于30℃培养至菌落可见为止。 19. 从Glc/CM-Ura-His-Trp 作主平板上挑菌或直接影印平板上菌落至以下平板上。 （1）Glc/Xgal/CM-Ura-His-Trp （2）Gal/Raff/Xgal/CM-Ura-His-Trp （3）Glc/CM-Ura-His-Trp-Leu （4）Gal/Raff/CM-Ura-His-Trp-Leu 20. 针对阳性菌落（在含Xgal平板上显蓝色，并可在Gal/Raff/CM-Leu如平板上生长但不能在Gcl/CM-Leu平板上生长的），采用快速小量制备方案从酵母菌中分离质粒DNA，将从15μl培养物制得的总DNA浓缩至5~10μl。 21. 用制备好的质粒DNA转化感受态细菌KC8。涂布于LB/氨苄青霉素平板，37℃过夜培养。 22. 在LB/氨苄青霉素平板上长出的菌落挑至或影印在添加了Ura、His和Leu但不加Trp的细菌极限培养基平板上，以选择pJG4.5质粒，37℃过夜培养。 23. 用小量制备细菌质粒的方案纯化含文库CDNA的质粒。 24. 为了分别在不同的转化实验中进行特异性验证，用步骤23纯化的质粒转化已含有下列质粒并生长在Glc/CM-Ura-His平板的酵母菌。 （1）含pSH18-34和pBait的EGY48 （2）含pSH18-34和pRFHM-1的EGY48 （3）含pSH18-34和非特异性诱饵的EGY48（可选） 25. 将每一种转化混合物涂布在Glc/CM-Ura-His-Trp省却成分培养基平板上，于30℃培养直到菌落生长出来。 26. 对每个待验证的文库质粒均涂布一个Glc/CM-Ura-His-Trp 省却成分培养基的主平板。即从每个转化平板上挑5~6个单独的菌落接种到。Glc/CM-Ura-His-Trp 平板上，于30℃培养至菌落上出来为止。 27. 从主平板上挑或影印菌落至在实际筛选中所用的同一系列的验证平板上： （1）Glc/Xgal/CM-Ura-His-Trp （2）Gal/Raff/Xgal/CM-Ura-His-Trp （3）Glc/CM-Ura-His-Trp-Leu （4）Gal/CM-Ura-His-Trp-Leu 28. 作特异性验证实验。分析并测定阳性质粒的DNA序列。 |
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