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Ca2+/钙调蛋白依赖性激酶分析实验一基本方案

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实验方法原理
实验材料	1mgml钙调蛋白（-70℃小量储存）有CaM激酶活性的酶样品10mmolL合成肽底物溶液
试剂、试剂盒	[γ-32P]ATP溶液5×CaM激酶反应缓冲液
仪器、耗材	30℃水浴
实验步骤	1.对1.5ml微量离心管做双管标记，每个反应按以下比例加入各反应组分： 5μl5×CaM激酶反应缓冲液 5μl10mmol/L合成肽底物溶液 5[γ-³²P]ATP溶液（ATP终浓度为5mmol/L，放射活性为5μCi/μl） 5μl1mg/ml钙调蛋白或5μl水 0～30μl水盖好离心管，混匀，放入30℃水浴温育10min。 2.每30s一管依次加入1～25μl酶样品开始反应。加入酶量的容积取决于样品中酶活性的大小。在预试验中所得的最大反应值可衡量磷酸转移反应的程度。在反应中为了保持磷酸基与底物的线性结合关系可适当减小酶的加量。 3.30℃水浴，10min。 4.温浴10min后迅速吸取30μl管中溶液滴在准备好的P⁸¹膜上。
注意事项	1.实验中每个反应的容积为50μl，但它可为25～100μl，只需根据比例对各反应组分进行适当调整。每个反应应分别设立无钙调蛋白的对照，以便能评估磷酸转移的反应本底，从而精确检测Ca2+/钙调蛋白依赖性的磷酸转移反应。 2.由于多肽不能被TCA有效沉淀，而进行PAGE分析需要一些特殊技术。因此，只有吸附在P⁸¹磷酸纤维膜上才能用于CaM激酶介导的磷酸转移测定。
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