低温保护剂诸如二甲基亚砜（DMSO）、甘油和丙二醇等已经被广泛用于冷冻保存细胞和组织。DMSO是细胞保存中最常用的渗透型冷冻剂，但它对细胞也存在一定的毒性，常温下能使胞内蛋白变性。DMSO导致的不良反应在动物实验中已被证实。在一些临床治疗案例中，注射了含有DMSO的造血干细胞的病人表现出恶心、头痛、高血压、腹泻和腹部绞痛等症状。因此 对于临床治疗的细胞保存应该尽量减少DMSO的用量，或将其替换为一种更安全的冷冻保护 剂。

另一方面，随着人们越来越关注DMSO对间充质干细胞（MSC）的效力及其分化潜力可能产生的损害，行业的技术人员们非常需要完全不含DMSO的无血清细胞冷冻保存溶液。

为了应对目前全球细胞治疗领域细胞冻存面临的挑战，全球领先的细胞培养基产品和服务供应商FUJIFILM Irvine scientific公司（富士胶片集团成员）开发一系列cGMP级别的用于细胞治疗的新一代无血清培养基，包括全球第一个无动物源、化学成分明确的T细胞无血清培养基，全球第一个无动物源、化学成分明确的NK细胞无血清培养基，用于高效病毒载体制备的悬浮203无血清培养基等产品，值得注意的是，FUJIFILM Irvine Scientific公司还推出了一种新型的无动物源、化学成分明确的、无蛋白质和无DMSO的细胞冷冻保存液，用于细胞的冷冻保存，该无血清细胞冻存液是cGMP级别，并已经在FDA获得了DMF，从而消除了使用中的监管顾虑。

下面我们一起看一下FUJIFILM Irvine Scientific公司公开的无血清冻存液相关的测试数据。

在研究中，技术人员同时和传统的DMSO冷冻保存溶液（含10％DMSO）进行对比，证明了使用新型DMSO-Free 冷冻保存液（货号 91149-10ml））对人脂肪来源、骨髓来源和脐带来源的间充质干细胞（AD-MSC，BM-MSC和UC- MSC）的良好效果。

方法

在细胞冷冻保存前和冷冻保存后，用PRIME-XV MSC Expansion XSFM培养基（FUJIFILM Irvine Scientific 公司的无血清间充质干细胞培养基，货号91149-250ml）扩增三种主要的MSC细胞。在相同的细胞接种密度下，MSC细胞用PRIME-XV FreezIS（10％DMSO）和PRIME-XV FreezIS DMSO-Free两种冻存液在液氮中冷冻2至5天。

存储后，将MSC细胞解冻并连续传代培养两次，评估细胞的形态、细胞活力、细胞标记物表达和细胞的分化潜能。 用PerCP-Cy5.5偶联的小鼠抗人CD45、APC偶联的小鼠抗人CD90和PE偶联的小鼠抗人CD105通过流式细胞术评估细胞标志物的表达。在染色检测前，MSC细胞分别在PRIME-XV成脂分化培养基中、PRIME-XV成骨分化培养基中和PRIMEXV 成软骨分化的培养基中培养2到4周来确定其分化潜能。

结果

在细胞解冻24小时内便可以观察到初步的差异，在无DMSO溶液中冷冻保存的细胞质量明显更优异。解冻后3天，在传代之前，我们观察到和预期MSC相当的塑料贴附能力和与成纤维细胞相似的形态（图1）。

图1: 在10％DMSO和无DMSO冷冻保存溶液中冷冻保存的MSC细胞形态学比较。将人脂肪来源的MSC细胞在含有10％DMSO和不含DMSO的冷冻保存溶液中冷冻。 解冻后，细胞在PRIME-XV MSC培养基中扩增。 观察到细胞附着和细胞形态。 以10X放大率拍摄图像。

10％DMSO和无DMSO冷冻的两组MSC细胞解冻后，通过两次传代直至80％汇合时，活细胞计数是相当的（图2）。

 图2: 在10％DMSO和无DMSO冷冻保存溶液中冷冻保存的MSC细胞扩增比较。 解冻后，同时通过两次传代，人脂肪来源（AD-MSC）、骨髓来源（BM-MSC）和脐带来源（UC-MSC）细胞计数统计。

所有MSC细胞都能够在涂有纤连蛋白的组织培养塑料设备表面上增殖，没有观察到标志物表达的差异。多次传代的MSC细胞，维持CD105和CD90的阳性表达，CD45阴性（图3）。

图3: 多次传代细胞维持MSC标志物表达：CD105和CD90阳性，CD45阴性。 人脂肪来源的MSC细胞在PRIME-XV MSC Expansion XSFM培养基中培养。 通过流式细胞术评估细胞标志物的表达。

同时没有观察到冷冻保存溶液对细胞的影响。所有三种类型的MSC细胞都保留了多谱系分化潜能。细胞形成可见的脂质空泡，呈现出典型的成脂分化。如预期的那样，细胞还具继续保持成骨分化能力。软骨细胞球体的冷冻切片和染色证明了聚集蛋白聚糖和II型胶原蛋白的存在，这是典型的成软骨分化（图4）。

图4: MSC细胞保留了多谱系分化潜力。 解冻后，将人脂肪来源的MSC细胞在PRIME-XV MSC Expansion XSFM培养基中培养。 将MSC细胞分化成（A）脂肪细胞、（B）骨细胞和（C）软骨细胞。 用（A）FABP-4（红色），（B）OSTEOCALCIN（绿色）和RUNX2（红色）和（C）AGGRECAN（红色）和胶原II型（绿色）染细胞。 细胞核用DAPI（A和C）复染。

结论

该研究发现在冷冻保存之前和之后，细胞的性能是相当的。 没有观察到细胞活力、CD105和CD90表达的有显著性差异。 在无DMSO细胞冻存液中冷冻的MSC继续能够保持其分化潜能。

总体而言，该研究证明了FUJIFILM Irvine Scientific公司成功开发了一种新的可替代传统含有DMSO冷冻保存环节的无血清细胞冻存液，该cGMP级别的冻存液具有无动物源、无蛋白、无DMSO的特点，从而可以尽量保证临床应用过程中细胞冻存环节的安全性，以更好地支持全球蓬勃发展的细胞治疗产业。

如果您对FUJIFILM Irvine Scientific公司上市的无DMSO、无动物源、无蛋白、化学成分明确的细胞冻存液感兴趣，或希望申请免费测试样品，可以发邮件至biopharma@irvinesci.cn进行索取。

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FUJIFILM Irvine Scientific公司目前在全球生物制药和细胞治疗领域主要提供一系列cGMP级别的无血清培养基，包括CHO细胞新一代无血清、化学成分限定培养基和高效浓缩的补料、新一代悬浮293细胞培养基和CHO瞬时转染培养基、定制化培养基开发和cGMP级别培养基干粉生产服务、新一代无血清、无动物源化学成分限定的T细胞培养基和NK细胞培养基、无血清无异源的干细胞培养基和无血清、化学成分限定的细胞冻存液等。

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