历时2年做出的实验结果，终于在文章投出的时候轻松片刻！但是，一个不留神就可能被要求补数据！

审稿人驳回RNAi文章，常常提出这样的建议：

1. In this study, to avoid the off-target effect, it's better to use two separate siRNA or shRNA of DcR3 to confirm its effect in the cells.

2. shRNA is needed or the authors need to re-express an shRNA-resistant STK32C to confirm that the results are not confounded by an off-target effect.

What？RNAi的坑到底在哪？

为了让大家避免“万事具备、只欠东风”的尴尬，今天就给聊一聊RNAi研究怎样避坑。

RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发、同源RNA高效特异性降解的现象，通常用于降低特定基因的RNA水平。

但在实际应用中，众多科研工作者只注重功能变化，忽略了RNAi技术缺点——脱靶（Off-Target：非靶基因抑制），若脱靶基因与靶基因位于同一信号通路或者与表型相关，则容易出现假阳性，对实验结果产生干扰，那么如何在实验设计前端就避免呢？我们先看下靶点设计过程：

图1

防止脱靶的第一步是Blast比对，即将靶点与对应物种核酸数据库比对，确保其与非靶基因含有至少3个以上碱基错配。

这就够了吗？NO!

按照Nature的标准，一个严格的RNAi介导knockdown实验要有6个对照：

1. 转染试剂对照（监控转染及培养条件对结果的影响）；

2.nonsense siRNA对照（监控外源核酸本身对结果的影响）；

3.positive siRNA对照（监控假阴性）；

4.重复对照（也叫off-target 对照，也就是利用至少2个靶点的siRNA同时实验，由于靶点序列不同，脱靶至同个基因的概率几乎为0，所以2个siRNA互为off-target control，当两者的表型相同时，才有可能是特异性的knockdown效应）；

重复对照的另一个途径是RNAi搭配基因编辑技术使用，分别在RNA、DNA水平的敲减操作既实现off-target control，又因为使用了不同的技术路线，提高了文章亮点[1]。

5.rescue对照（也称回复突变或者拯救实验：将siRNA与靶基因结合处进行同义突变，并将该序列在已knockdown的细胞内过表达，看是否有性状的逆转，若逆转，表示性状的改变同靶基因相关；若无逆转，则性状的改变是因为脱靶造成的）；

6.全表达组扫描对照（就是转录/表达芯片扫描，以最终确定表型不是由于off-target造成）。

以上六组对照，前三组是基础；第6组鲜有文献涉及，可以舍去；4或者5任做一组即可，若提交的文章不含组4、5，审稿人会依据自己的偏好做指定要求。

审稿人对脱靶的担忧是多余的吗？我们再看看脱靶数据及原因：

一 siRNA剂量引发脱靶效应

高浓度的siRNA与非靶基因结合概率增大，从而诱发off-target。

Caffrey[4]做了不同浓度的脱靶研究，以图2红框内前三个STAT3靶点为例，25nM、10nM、1nM的siRNA分别造成38、1、0个脱靶。由此可见，1~2倍的siRNA剂量差异可引发指数级的脱靶效应。而大多数全基因组和生物筛选的siRNA浓度通常为25nM至100nM，远高于文章使用的剂量，且载体表达的siRNA依靠U6、H1启动子表达，siRNA剂量因启动子在不同细胞活性差异以及siRNA本身结构的影响，无法精确控制siRNA浓度。

图2

二 siRNA种子区引发脱靶效应

miRNA主要依靠种子区（seed region,指成熟体5’端 2-8个碱基）与靶基因的3'UTR区结合,抑制翻译。siRNA同miRNA产生机制类似（图3），也可通过种子区结合特征产生非靶抑制现象。图2数据显示，非靶基因下调总数/符合种子区特征：56/32，30/22（以前两个为例）；Jackson[5]也论述了脱靶效应与seed region的对应关系（图4），seed region结合占脱靶比率超过50%(而脱靶引发的上调不符合种子区结合原则)。

浅蓝色表示下调的转录物

红色表示上调的转录物

灰色表示无显著变化的转录物

深蓝色表示符合种子区结合的下调转录物

序列表示靶点并标记出种子区

RNAi天生带有原罪，载体表达的siRNA剂量不可控；siRNA依靠部分碱基结合非靶基因诱发的脱靶效应无法避免；经过dsRNA剪切产生的siRNA正义链也可参与脱靶效应……因此，实验设计的合理性至关重要。

如果您在做这方面的研究，但是还未做4或5的对照，小编强烈建议您赶紧补充一下吧，以免投稿后再补充数据。

如果您有相关问题，请给我们留言！

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参考文献：

1.MLL3 Is a Haploinsufficient 7q Tumor Suppressor in Acute Myeloid Leukemia

2. The tumor suppressor CDKN3 controls mitosis

3. Ovol2 knockdown phenotype is rescued by expression of shRNA-resistant mutant Ovol2

4. siRNA Off-Target Effects Can Be Reduced at Concentrations That Match Their Individual Potency

5.Widespread siRNA “off-target” transcript silencing mediated by seed region sequence complementarity