PCR是极为重要的DNA增殖技术，应用层面非常广，其中包括了核酸探针的制备。如果一段DNA已经被次选殖至载体上，要以PCR扩增这段DNA时，可根据质体multiplecloningsites两边的序列，选用适当的核酸引子（universalprimers）进行扩增反应；比较常用的引子包括SP6,T3与T7promoterprimer,M13/pUCforward与reverseprimers等；若有特殊考量，也可以使用序列专一性核酸引子对。进行PCR反应时若同时添加[α-32P]dNTP或DIG-11-dUTP,所增殖的DNA即被32P或DIG所标定，所以PCR是制备核酸探针非常便捷好用的方法。

仪器用具：微量离心机；PCR反应器

药品试剂：

模版DNA:pBlueGus质体DNA（~50pg）

核酸引子对：T3promoterprimer与T7promoterprimer（各2μM）

矿物油（是否需要视PCR反应器机型而定）

PCRDIGprobesynthesiskit（Roche），内含：

TaqDNApolymerase（ExpandHighFidelity,3.5U/μL）

10×PCRDIGprobesynthesismix（2mMdATP,dCTP,dGTP,1.9mMdTTP,及0.1mMDIG-11-dUTP,pH7.0）

ExpandhighfidelitybufferwithMgCl2（10×）

方法步骤：

以下反应条件主要参照PCRDIGprobesynthesiskit制造厂商所提供的产品说明。

1）取一支0.5mL微量离心管，依下表逐一加入各项试剂（单位μL）：

2）以手指头轻弹管壁使各项试剂混合均匀。

3）短暂离心后，徐徐加入100μL矿物油。

◆有些PCR反应器不需使用矿物油。

4）在PCR反应器上设定PCR反应条件：Denaturation:94℃/10min

扩增反应：

30循环的[94℃/45s→55℃/1min→72℃/2min]

最后的elongationstep:72℃/10min

5）将微量离心管移至反应器上，并开始进行PCR反应。

6）反应完成后，以微量移液器吸出矿物油，并取出5μLPCR反应产物，进行洋菜胶体电泳分析。

PCR技术核酸探针核酸探针的制备方法