恒温扩增仪

PCR实验操作步骤|pcr基因扩增仪|pcr扩增仪|基因扩增技术

PCR是极为重要的DNA增殖技术,应用层面非常广,其中包括了核酸探针的制备。如果一段DNA已经被次选殖至载体上,要以PCR扩增这段DNA时,可根据质体multiplecloningsites两边的序列,选用适当的核酸引子(universalprimers)进行扩增反应;比较常用的引子包括SP6,T3与T7promoterprimer,M13/pUCforward与reverseprimers等;若有特殊考量,也可以使用序列专一性核酸引子对。进行PCR反应时若同时添加[α-32P]dNTP或DIG-11-dUTP,所增殖的DNA即被32P或DIG所标定,所以PCR是制备核酸探针非常便捷好用的方法。

仪器用具:微量离心机;PCR反应器

药品试剂:

模版DNA:pBlueGus质体DNA(~50pg)

核酸引子对:T3promoterprimer与T7promoterprimer(各2μM)

矿物油(是否需要视PCR反应器机型而定)

PCRDIGprobesynthesiskit(Roche),内含:

TaqDNApolymerase(ExpandHighFidelity,3.5U/μL)

10×PCRDIGprobesynthesismix(2mMdATP,dCTP,dGTP,1.9mMdTTP,及0.1mMDIG-11-dUTP,pH7.0)

ExpandhighfidelitybufferwithMgCl2(10×)

方法步骤:

以下反应条件主要参照PCRDIGprobesynthesiskit制造厂商所提供的产品说明。

1)取一支0.5mL微量离心管,依下表逐一加入各项试剂(单位μL):

2)以手指头轻弹管壁使各项试剂混合均匀。

3)短暂离心后,徐徐加入100μL矿物油。

◆有些PCR反应器不需使用矿物油。

4)在PCR反应器上设定PCR反应条件:Denaturation:94℃/10min

扩增反应:

30循环的[94℃/45s→55℃/1min→72℃/2min]

最后的elongationstep:72℃/10min

5)将微量离心管移至反应器上,并开始进行PCR反应。

6)反应完成后,以微量移液吸出矿物油,并取出5μLPCR反应产物,进行洋菜胶体电泳分析。

PCR技术核酸探针核酸探针的制备方法

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