抗坏血酸过氧化物酶（ascorbateperoxidase，APX）活性测定试剂
 
盒说明书
 
分光光度法50管/48样
 
注意：正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。
 
测定意义：
 
APX是植物清除活性氧的重要抗氧化酶之一，也是抗坏血酸代谢的关键酶之一。APX具有多种同功酶，分别定位于叶绿体、胞质、线粒体、过氧化物和乙醛酸体，以及过氧化体和类囊体膜上。APX催化 H2O2 氧化 AsA，是植物 AsA的主要消耗者。APX的活性直接影响到 AsA的含量，APX与 AsA具有一定的负相关性。
 
测定原理：
 
APX 催化催化 H2O2 氧化 AsA，通过测定 AsA氧化速率，来计算得 APX活性。
 
自备仪器用品：
 
低温离心机、紫外分光光度计、1mL石英比色皿、移液枪、研钵、冰和蒸馏水。
 
试剂组成和配制：
 
试剂一：液体 90mL×1瓶，4℃保存。
 
试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加 5mL蒸馏水充分溶解。
 
试剂三：液体 5mL×1支，4℃保存。
 
粗酶液提取：
 
按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。13000g，4℃离心 20min，取上清置冰上待测。
 
测定：
 

• 分光光度计预热 30min，调节波长到 290nm，用蒸馏水调零。

 

• 试剂一在 25℃中预热 30min。

 

• 依次在 1mL石英比色皿中加入 100μL上清液、700μL 预热的试剂一、100μL 试剂二和

 
100μL试剂三，迅速混匀后在 290nm测定 10s和 130s光吸收 A1和 A2，△A=A1-A2。
 
APX活性计算公式：
 

• 按样本蛋白浓度计算

 
活性单位定义：每毫克蛋白每分钟氧化 1μmolAsA为 1个酶活单位。
 
APX(μmol/min/mgprot)=△A÷(ε×d）×V反总×10⁶÷(Cpr×V样)÷T
 
=1.79×△A÷Cpr
 
（2）按样本质量计算
 
活性单位定义：每 g组织每分钟氧化 1μmolAsA为 1个酶活单位。 APX(μmol/min/g鲜重 )=△A÷(ε×d）×V反总×10⁶÷(W×V样÷V样总)÷T
 
=1.79×△A÷W
 
ε：AsA在 290nm处摩尔吸光系数为 2.8×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径（cm），1cm；V反总：反应体系总体积（L），1000μL=1×10^-3 L；10⁶：1mol=1×10⁶μmol；V样：加入反应体系中上清液体积（mL），100μL=0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司 BCA蛋白质含量测定试剂盒；W：样本质量，g；T：催化反应时间（min），2min。
 
注意事项：
 
配制好的试剂二 4℃保存，并且3 天内使用完。