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Conjugation of Antibody to HRP

蚂蚁淘  /发布时间:1631208604 /浏览量:246   

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/**/
Author:NanciDonacki
Source:ContributedbyNanciDonacki

ReagentsandMaterials

  1. PBS
  2. PBS:0.05MEDTA
  3. PBS:0.01%thimerosal
  4. ConjugateStorageBuffer
  5. SATA
  6. DMF
  7. Hydroxylaminehydrochloride
  8. NaOHPellets
  9. PD10ColumnorSephadexG25
  10. Sulfo-SMCC

PreparationofThiolatedAntibody

  1. Concentratetheantibodyto5-7mg/ml
  2. Dissolve10mgofSATAin1mlDMF(SATA:DMF)
  3. Add3.0mlSATA:DMFpermgofantibody
  4. Gentlystirsolutionfor2hoursatroomtemperature.
  5. Dissolve0.5ghydroxylaminehydrochloridein10mlPBS:EDTA
  6. Add0.25gNaOHpelletstothissolutiontoneutralizetoapproximatelypH7.0
  7. Addtoantibodysolutionat6.49ml/mlSATA.
  8. Gentlystirfor30minutesatroomtemperature.
  9. EquilibratecolumnwithPBS:EDTA.
  10. Desaltthiolatedantibodyoncolumn.CollectinthesmallestvolumepossIBLewithoutcollectinganySATA.AllowfreeSATA(2ndpeak)tocomeoffthecolumn.
  11. Storethethiolatedantibodyat2-8oCfornomorethanonehour.
  12. Re-equilibratethecolumnwithPBS.

PreparationofMaleimide:HRP

  1. Weighout1.067mgHRPforeachmgofthiolatedantibody.
  2. Add1.1mgSulfo-SMCCpermgofHRP
  3. AddPBStoafinalconcentrationof8mg/mlHRP
  4. Mixfor2hoursonarotator.
  5. DesalttheHRPonPBSequilibratedcolumn.Collectthefirstpeak.

PreparationofAb:HRPConjugate

  1. ImmediatelymixtheHRPwiththethiolatedantibodyat1mgHRPpermgantibody.
  2. Gentlystirfor16-20hoursat2-8oC.
  3. Dialyzeagainst3changedofPBS,changingevery2hours,100Xtheconjugatevolume.
  4. Dilutetheconjugate2-foldinConjugateStorageBuffer.SterileFilter.