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“微滤+超滤“让外泌小体制备更方便高效

mayitao /发布时间:1530061816 /浏览量:121

外泌小体（Exosome）是一种囊泡结构，直径通常在30-150nm，常见于正常体液和病理样本，培养细胞也可分泌。其运载的蛋白和核酸涉及其细胞间物资、信息交流，影响和调控着多方面的生理功能，包括肿瘤发生、免疫促进、凋亡调控、血管生成、炎症反应及发育和分化等。由于在体液中出现，外泌小体对于临床生物标志物检测特别有利，成为体外诊断、bioMarker研究的新热点。

作为一个日益火爆的研究载体，外泌小体的国家自然科学基金项目数量也在逐年飙升，2017年国自然外泌小体项目已经超过300项，总资助经费超过1亿元，成为新的研究热点。

外泌小体研究思路

抓住新的研究热点将会让你的工作事半功倍，下面是外泌小体通过传递lncRNA使靶细胞中的lncRNA上调，lncRNA进而抑制miRNA丰度，从而促进肿瘤进展的实例：

Exosome-TransmittedlncARSRPromotesSunitinibResistanceinRenalCancerbyActingasaCompetingEndogenousRNA.CancerCell.2016May9;29(5):653-68.doi:10.1016/j.ccell.2016.03.004.Epub2016Apr21.

进一步可以探索外泌小体如何实现lncRNA的传递？RNA在外泌小体和细胞浆中的含量是否一致？如果不是，RNA怎样实现在外泌小体中的富集？

对于外泌小体的研究思路还有很多，但外泌小体研究最关键的步骤之一是怎样方便，高效，标准化地分离纯化外泌小体。经过近20年的探索，已经建立了超速离心法、沉淀法、色谱法、亲和纯化法等。因不需要特殊的设备和试剂盒，对操作人员也没有特别的经验要求，且具有价格优势，超滤法后来居上，成为实验室中制备外泌小体的通用方法。

默克建立了基于“微滤+超滤”的外泌小体制备操作标准，相较于需要昂贵的设备及繁琐操作的超速密度梯度离心，用实验室常见的工具就可以高效解决外泌小体制备这个”高大上”问题。

细胞上清的外泌小体分离仅需两步

第一步：样品收集，微滤除细胞碎片

细胞生长至汇合

收集细胞培养上清

离心/抽滤去除细胞及细胞碎片(300g,10min)

使用Millex®针头式滤器（适合1-100mL样品）

或Stericup®过滤杯（适合100-1000mL样品）

过滤去除囊泡等大颗粒物质

Millex®针头式滤器

（适合1-100mL样品）

Stericup过滤杯

（适合100-1000mL样品）

第二步：超滤制备外泌小体

微滤后无血清样品使用Amicon®Ultra-3KDa超滤管（<50mL），CentriconPlus70-3KDa超滤管（50-200mL），或Amicon®搅拌式超滤杯配套3KDa膜片（>200mL）超滤制备外泌小体。

微滤后含血清样品使用Amicon®Ultra100KDa超滤管（<50mL），CentriconPlus70100KDa超滤管（50-200mL），或Amicon®搅拌式超滤杯配套500KDa膜片（>200mL）超滤制备外泌小体。

Amicon®Ultra超滤管

CentriconPlus70

Amicon®搅拌式超滤杯

注意事项：

无血清样品选择3kDa孔径是为了尽可能提高外泌小体的回收率。
有血清样品选择100kDa/500kDa孔径是为了尽可能去除细胞分泌蛋白以及血清成分中小于外泌小体的白蛋白造成的影响。
研究者可根据样品的粘稠程度，以及需要制备的目标外泌小体/囊泡/颗粒的大小分布来选择和优化超滤孔径
(3kDa/10kDa/30kDa/50kDa/100kDa)，以便达到更好的得率和操作体验。
样品体积大于30mL时可以考虑用超滤杯或Centricon-70超滤管，请注意搅拌式超滤杯在200mL以内时吸附损耗可能较离心式超滤管略偏高。
如需进一步提高特定外泌小体的纯度，可选用包被相应抗体的磁珠进行亲和纯化精制。

可选步骤：

外泌小体用于细胞学或动物实验前的无菌处理

经过上述方法制备的外泌小体在进行细胞或动物实验之前使用Ultrafree离心式微滤管进行一步除菌过滤（离心法处理的得率更高）。

Ultrafree离心式微滤管

超滤法制备外泌小体结果数据

多维度分析4个SH-SY-5Y细胞系的外泌小体样品（含或不含血清）

不同方法制备外泌小体产量比较

不同截留分子量的超滤管外泌小体制备产量比较

不同方法制备外泌小体产量比较

默克超滤法制备的外泌小体电镜照片（放大倍数87000×)，小体直径16-82nm，有些达到485nm

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