2018-01-22【旧贴整理】花了2星期系统归纳关于PCR的各位老师旧帖,与大家分享 PCR

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展开引用yyangyingy常规PCR一般注意点：1）PCR模板是关键，引物可以优化。制备模板的时候，一定要注意核酸模板的纯度和量。纯度上要避免杂质和杂蛋白质的混入，同时还要注意添加模板的量，模板很理想的话，不用加太多，加的多了，混进去的杂质机会就多了。当模板的浓度过低,比如低于100个分子时,引物和模板之间就很难发生反应.引物容易自身进行反应形成二聚体.用boosterPCR,即开始几个cycles保持primer的低浓度,保证primer:template的molarratio在107~108.以确保开始扩增的准确性.然后boostePrimer的浓度到正常的水平2)退火温度是从55度开始.根据情况配合以Mg离子浓度进行调整.有条件的可以做grADIentpcr.退火的时间在30-60S,时间短一些可以得到更好的效果.3）首先是你的TAQ酶要在冰上操作，以免失活（Taq酶容易失活所以冬天最容易出结果），TAQ酶使用时最好分装。再就是你的引物以及DNTP和模板操作完后一定放进冰箱，注意不要污染，PCR完成后要及时从PCR仪取出（如果你的PCR仪没有保温功能），如果你放在外面时间较长可以放－20度冰箱（尤其片段比较小时）。TAQ酶一般比较稳定,按照一般的惯例,分子生物学的东西从转运到加样,全部要在冰上操作要注意的是,DMSO,GLYCEROL等会抑制polymerase的活性,所以需要scouting出最适的浓度.可以加入一些nonionic试剂,如Tween,Nonid,Trition之类的反过来抑制SDS.还有proteinaseK也要除干净,不然会降解polymerase.一些高保真没的效率要远远低于Taqpolymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些.另外,一般的情况下,变性的温度可以使用90~92度,变性的时间也可以缩短,4)Mg离子的作用主要是dNTP-Mg与核酸骨架相互作用并能影响Polymerase的活性，一般的情况下Mg的浓度在0.5-5mM之间调整，同样要记住的是在调整了dNTPs的浓度后要相应的调整Mg离子的浓度PCR实验中出现的问题及对策：一、非特异性条带原因：1>引物特异性差2>模板、引物↑;3>酶过量;4>Mg离子浓度↑;5>Tm↓;6>循环次数太多;7>被基因组DNA污染对策：1>重设引物;2>引物、模板↓;3>减少酶量;4>Mg浓度;5>Tm适当;6>减少循环次数7>重新处理样品具体措施:1、Primer浓度过高，建议以0.1uM间隔递减2、酶量过多，建议0.5U间隔递减3、循环次数过多，建议2个循环间隔递减4、Anneal温度过低，以1度间隔递增。不迷信文献上所谓的退火温度。摸下梯度，范围应该是Tm-10和Tm+5。一般选Tm值低5度的温度开始摸条件，很难摸出时可以使用降落PCR，普通的9600PCR仪也可以做，只是程序麻烦些。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。5、采用Hotstart法或Coolstart法，减少从室温上升到变性温度过程中引起的Primer非特异性Annealing。简易热启动的方法是加样时最好在冰上加，当然可以做个简易冰盒，直接在94度放入样本到机器，效果不错。6、Template量过多，Template量以20%递减。PCR模板是关键，引物可以优化。制备模板的时候，一定要注意核酸模板的纯度和量。纯度上要避免杂质和杂蛋白质的混入，同时还要注意添加模板的量，模板很理想的话，不用加太多，加的多了，混进去的杂质机会就多了。7、Extension时间过短，30s间隔递增。二、带微弱1.出现的现象：扩增带时有时无，出现时与国外文献中的照片相似，不出现是则看不到或者非常弱。2.曾用的解决方法：换过PCR中所用的试剂。甚至想到引物之间可能有二聚体等影响结果（虽然文献中及自己的实验中有时能出现很好的结果，但实在是万般无奈），把各引物单独或者两两结合进行试验，时好是坏。3.思考：第一点，是否是管子的问题？管子的质量不是很好（为了便宜），特别是外形不是很规矩，与扩增仪上的管孔结合不紧密，又不经常加油，而原装管子则与管孔结合较紧密。是否由于此而使管内温度与实际设定温度不符呢？第二点，那么是否是变性温度较高使酶过早的失活？虽然扩增的产物很弱，但分子量是相符的，说明扩增在进行，只是产物量较少，这可能与Taq酶的活性有关.4.最后解决：将变性温度由文献的95℃改为94℃，问题解决。以后各次扩增均得到满意的结果。三、设立对照设立阴性对照检测是否被基因组DNA污染。如果阴性对照的PCR结果也显示同样条带，则需要用重新处理样品。设立阳性对照可以检测是否模板CDNA及引物有问题。空白对照：加的是“水”——出现“区带”待检样品：加的是“模板”——无“带”说明：1，水被污染2，模板阴性四、遇到意外继续实验PCR体系遇到停电就放在4度1天，还可以扩出来，意外时不要扔还可以做一次啊PCR操作注意点1、写好试剂标签1）对于需要存放的试剂、样品，都有明确的标签，套小的密实袋，离心管上有品名、浓度、日期，在密实袋上会重复写一次；2）实验记录上还会记下新来试剂的存放日期；3）用成品试剂盒时，除了会在实验记录上记下某日用量多少，还会在试剂盒盖内侧标明某日用量。2、管子放置做大批量PCR用八连管，八连管的盖子有一端有缺口，有缺口的那段向着自己，有时碰到盖好后没有拿稳掉下来，也能准确无误的分清楚前后次序。3、准备工作实验之前，试剂器皿仪器都准备妥当，且在脑海中将实验目的和步骤联系起来再进行一遍对比检查，确认无误后，就快速准确的动手实验。1）酶和dNTP最好分装．dNTP的质量与浓度:　dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或1MTris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。2）PCR前，将枪等物品放在超净台中，用紫外照射半小时，可以破坏DNA，防止气溶胶污染等。但是，PCR不一定非要在超净台进行，如做质粒PCR就不那么严格．3）PCR时，试剂化冻后，都稍稍振荡（手弹或者颠倒混匀），离心后再取（通常几秒钟，当转速到2000转左右关离心机）。（1）较均匀；（2）盖上沾的试剂被离下，不浪费试剂和减少污染。质粒DNA在取用之前，混匀的时间要稍长些。4）PCR反应体系需要在冰上进行配制，以免酶失活或者核酸降解，反应用的器皿和微量离心管都需要进行严格的灭菌。5)，两个引物可以加在一起分装或单独分装都可以.4、预热PCR仪上样前,预热PCR仪,对于PFU酶比较关键，先设置好PCR的程序然后再去配体系，别配好体系才想起PCR仪还没开。5、加样：1》、加样顺序1）按照buffer-dNTP-引物-模板-Taq酶－水这个顺序加,不易起泡.2）或加样顺序倒没有特别要求，只是Taq酶要注意最后加，加完就放到冰箱里或通常在冰箱里面加酶。然后按体积从大到小地一一加入.3）或珍贵的、易引起污染的物质先加。比如1、如果样品DNA很稀少，很宝贵，避免DNA间的污染就要首先考虑：第一步先加水，第二步就紧接着加DNA，这样加相同DNA就可以不换TIPS，又不会在DNA中污染引物等其他东西。比如2、如果用随机引物，缓冲体系和酶就要重点保护？？？，先加它们再加引物和模板。比如3、如果用的酶有外切活性，如PyroBest，pfu，就必需把酶放到最后加，否则他们有可能把引物都折磨得面目全非。2》、混合加样若做多管的PCR，可先加一起，再用枪分取比如要做n管，就把除模板之外的其他部分按照n+1份配好，然后再分装，如：10xbuffer5uldNTP4ul引物11ul引物21ultaq酶1ulddw34ul模板2ul共有9个模板，就把除模板外的其他成分乘10，即buffer50ul，dNTP40ul，引物110ul，引物210ul，taq酶10ul，ddw340ul，加到一个离心管中，加盖，用力振荡使混匀（这步是必要的，否则分到各管中的体系不均匀），稍稍离心一下，然后分装至9个PCR管中，每管48ul，再依次加入模板2ul，混匀，稍稍离心，上机3》、保证把微量的反应物加进去1）枪头的下端紧贴液面(不要伸进去太多)，若看见有一个小水滴掉进去，证明已经加进去。不过我不赞成紧贴液面加，可能加进空气。所有的试剂都加完后，要用枪混匀，然后用手动离心机离一下，使之没有气泡，不要用手剧烈震荡tube2）枪头不能挨到液面(加在管壁上瞬时离心)，否则使某些物质的量减少，所以我们加样的时候都采取螺旋式加样的方法，也就是加样时沿着管壁螺旋式上升，等全部加完后离心混匀，如果有气泡，用手指轻轻弹几下，气泡就没了（有时ep管内有气泡，反正p时要加温，发现最后结果相差不大），而且确保液体都在管底。3）在用单个0.2mlPCR薄壁管做反应时，加在管壁，而不是管底，在管壁形成一个小液滴，每个小液滴都孤立存在，用手弹管壁最后离心。在加大量的药品时,如果1ml枪头一下吸满了液体,在枪头提出容器时,枪头尖端可能会存留一滴液体,很容易造成污染和浪费.我的技巧是在枪头提出容器时,将枪头放平,这样枪头尖端会有一个气泡,从而阻止了液体滴的形成!4》、避免漏加或重复加1）事先列出清单，准备两个冰盒.将所有的试剂放在一个冰盒上。加完的转移到另一个冰盒,加样以固定的顺序加,这样不容易弄错。2）少量加样时，可以把试剂分别先加到EP管壁，这样不仅可以确定是否加上了试剂，还可以通过目测比较各种试剂加样是否准确；3）加样时，将所有的试剂放在冰盒上。没加的在一侧，加完的转移到另一侧。4）将PCR试剂放在最右边的竖排，再将EP管从左边开始横排放，在每加一种试剂后一定要将EP管挪动一排，这样就可以清楚的区分哪些管加了5）还有如没有太大影响的话，将加完的合上盖子，没加的盖子打开。6）泡沫（软的那种）制作了个板子，把ep管放上去，在加样时用枪尖压下5》、准确浓度：1）试剂完全化后再加样，浓度准确。像镁离子，融化后最后用枪头再吹打完全混匀。2）各种酶，用之前瞬时离心一下，如果买的大包装的，最好分装一下，以避免反复冻融。3）试剂用之前瞬时离心一下.6》、注意枪头和枪是否结合紧密，否则误差将会很大；7》、枪头：枪头要买好的，不然你有好枪也没用。......

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我要做的是药物对肿瘤细胞的影响要做细胞凋亡我想看药物组与对照组的基因表达有何不同不知能否用DDRT-PCR这只是我的初步设想不知可行否请赐教