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2021-09-05【主题学习】CRISPR/Cas9 基因敲除技术

小刀188
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基因敲除、阳性单克隆筛选、真核细胞、斑马鱼、基因组、植物
CRISPR（ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats）RNA，是最近几年才发现的原核生物中的调控RNA，用以抵御病毒和质粒入侵。在II型CRISPR系统中，CRISPRRNA（crRNA）与转录激活crRNA（Trans-activatingcrRNA,tracrRNA）退火形成的复合物能特异识别基因组序列，引导Cas9核酸内切酶在目的片段生成DNA双链断裂（double-strandbreaks,DSBs）。CRISPR-Cas系统的高效基因组编辑功能已被应用于多种生物，包括人、小鼠、大鼠、斑马鱼、秀丽隐杆线虫、植物及细菌。多个科研小组的研究都显示，与锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活样效应核酸酶（Transcriptionactivator-likeeffectornucleases,TALEN）相比较，CRISPR-Cas系统介导的基因组靶向实验在真核细胞中具有相似甚至更高的效率。
剪刀手生物专注于基因编辑多年，最新推出基因组编辑工具CRISPR/Cas9专家系统，该系统灵活简单、可以对特定基因组位点进行切割置换，特异性高、细胞毒性低。CRISPR/Cas9系统可广泛应用于基因组工程，如基因抑制，基因敲除，基因敲入，基因修复等。CRISPR-Cas9体系为基因组工程研究提供了一项简便而强大的工具。
作为一种新的基因编辑技术，CRISPR/Cas9有以下特点和优势：
1、操作简单，靶向精确性更高。
2、CRISPR/Cas9系统是由RNA调控的对DNA的修饰，其基因修饰可遗传。
3、基因修饰率高，基因调控方式多样，例如敲除、插入、抑制、激活等
4、可实现对靶基因多个位点同时敲除。
5、无物种限制。
6、实验周期短，最快仅需1个月，节省大量时间和成本。
CRISPR/Cas9的应用中，活性检测或是突变效率的检测：
错配酶法靶序列经Cas/sgRNA切割后由于缺乏修复模板，将主要以非同源重组的方式进行修复，或多或少会插入或删除一些碱基。因此将靶序列PCR扩增后经变性、退火，将形成错配。错配酶将识别错配的杂合双链并剪切。产物跑电泳，比较切割条带与未切割条带的比例，即可反映出Cas/sgRNA的活性。

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回复：时间：2014-07-18

小刀188 切断后，基因组启动自主修复机制， 总会缺失或增添几个或几百个碱基，导致基因组发生移码突变，达到基因敲除的目的。 你好 我想请教一下 比如基因敲除小鼠 小鼠体内不都有同源染色体么在没有外源同源模板情况下 怎么能保证基因修复不会利用自身同源修复模板进行HDR修复呢？这样不就不能达到敲除目的了吗 谢谢！

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回复：时间：2014-07-19

学习下，谢谢楼主的分享啊

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回复：时间：2014-07-11

楼主在哪高就啊，有空私聊啊，我也是做crispr的，多多交流经验

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回复：时间：2014-07-17

敲除的，还是不太明白，求指教！

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回复：时间：2014-07-15

自由悠悠敲除的，还是不太明白，求指教！你敲的是什么细胞，人，小鼠，斑马鱼，植物（水稻，烟草）or细菌

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回复：时间：2014-07-20

楼主你好，下一步实验需要做肿瘤细胞内的目的基因的敲出，crispr/cas9方面看了几篇文献，但是整体思路以及载体构建方面不是太了解，求指教~~

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回复：时间：2014-07-19

留个联系方式，我给你发一些关于CRISPR/Cas9的资料

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回复：时间：2014-07-21

额，刚接触到这个领域，还处于入门阶段。。。

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回复：时间：2014-07-14

【实验流程】从gRNA设计→CRISPR载体构建→细胞转染→KO阳性克隆筛选，完整解决方案！

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回复：时间：2014-07-22

学习了

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回复：时间：2014-07-11

楼主资料可否也发我一份多谢biofrankie@gmail.com

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回复：时间：2014-07-15

有关于CRISPR/Cas9转基因小鼠的资料吗？谢谢！求求：390711992

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回复：时间：2014-07-19

想请教一下LZ，PAM序列例如NAG中的N我如果理解为任何碱基的话，那么“5’-NNAGAAWforStreptococcusThermophilusCRISPR1”中的W我应该怎么理解呢？

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回复：时间：2014-07-20

见私信，加我QQ

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回复：时间：2014-07-18

想在灵芝里做，期望楼主给予意见。

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回复：时间：2014-07-15

新手：CRISPR能做基因敲除，通过gRNA定位到目的基因然后切断，我的问题是细胞自身不是会同源重组吗？那切断后又会同源重组吗，这样不是不能敲除目的基因了吗？？我做人食管癌细胞系KYSE70，想做P53基因敲除，我的质粒是PSPCAS9(BB)-2A-GFP(PX458),通过流式分选GFP阳性细胞，然后通过PCR和WESTERN验证基因敲除效率。

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回复：时间：2014-07-20

切断后，基因组启动自主修复机制，总会缺失或增添几个或几百个碱基，导致基因组发生移码突变，达到基因敲除的目的。

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回复：时间：2014-07-15

小刀188切断后，基因组启动自主修复机制，总会缺失或增添几个或几百个碱基，导致基因组发生移码突变，达到基因敲除的目的。你好我想请教一下比如基因敲除小鼠小鼠体内不都有同源染色体么在没有外源同源模板情况下怎么能保证基因修复不会利用自身同源修复模板进行HDR修复呢？这样不就不能达到敲除目的了吗谢谢！

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回复：时间：2014-07-22

您好，我的目的是敲除肿瘤细胞里的一个基因，那么我在构建载体选择靶点的时候，靶点的位置有什么要求吗？比如靠近5‘端？中间或者是靠近3’端？希望指教~谢谢

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回复：时间：2014-07-19

请问cas9/grna注射时加镁离子了吗？

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回复：时间：2014-07-22

想问一下，tracrDNA和crDNA形成的sgDNA具有特异性识别能力这两者不都是细菌自身产生的吗？如何识别我想要的靶基因？

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回复：时间：2014-07-15

各位好，我想请教一下CRISPR/Cas9可否用在HUVEC细胞中。哪些文章中有实例或者哪位自己做过呢?求指教

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回复：时间：2014-07-15

duanyaoyun各位好，我想请教一下CRISPR/Cas9可否用在HUVEC细胞中。哪些文章中有实例或者哪位自己做过呢?求指教可以做的，这个已经有很多实验室在做了

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回复：时间：2014-07-21

请问有用这种方法在细菌耐药方面的研究的人呀？

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回复：时间：2014-07-19

楼上已阅

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回复：时间：2014-07-14

楼主，你好，我想敲除肿瘤细胞中的一个基因，想了解具体的转染以及细胞系构建的过程。谢谢

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回复：时间：2014-07-20

楼主你好，我也是刚刚接触到CRISPR/Cas9，能把资料也发给我一些？另外请问能否用这个技术对基因组某些特定位置的拷贝数突变进行功能学验证？

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回复：时间：2014-07-14

Marker

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回复：时间：2014-07-14

大家有问题可以到日志里去了解，我就不一一解答了，有问题可以在我的空间日志下面留言，我会不定期给大家统一回复

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回复：时间：2014-07-15

刚开始接触CRISPR/Cas9，请楼主发点资料，谢谢啦

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回复：时间：2014-07-15

学习，楼主辛苦

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回复：时间：2014-07-14

楼主，你好!最近我在做斑马鱼cas9敲除实验，遇到了一点问题，我的基因怎么敲也没有效果，已经试了6个gRNA了。阳性对照我是做出来了，不知道问题出在哪，我的基因本身基因组测序不完全，而且外显子的片段比较小，只知道前面一部分的基因组序列，现在这部分的gRNA已经设计完了，还是没有效果，不知楼主有没有相关经验，给予我一些指导，谢谢！

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回复：时间：2014-07-14

请问CRISPR技术可以用来编辑原代细胞吗？转染效果怎么样呢？谢谢！！

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