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原理和操作方法（全）

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工作原理

蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一

,

电泳是指带电粒子在电

场作用下

,

向着与其电荷相反的电极移动的现象

.

根据所采用的支持物不同

,

有琼

脂糖凝胶电泳

,

淀粉凝胶电泳

,

聚丙烯酰胺凝胶电泳等

.

其中

,

聚丙烯酰胺凝胶电泳

(PAGE)

由于无电渗作用

,

样品用量少

(1-

100μg),

分辨率高

,

可检出

10-9-10-12mol

的样品

,

凝胶机械强度大

,

重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的

比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广旱挠

τ?

SDS-PAGE

是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式

,

特别是用于蛋白质纯度检测

和测定蛋白质分子量

.

PAGE

能有效的分离蛋白质

,

主要依据其分子量和电荷的差异

,

而

SDS-PAGE(SDS

变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳

)

的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异

,

因为

SDS-PAGE

的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含

有

SDS

和巯基乙醇

(2-ME)

或二巯基赤藓醇

(DTT),

其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键

,

破坏蛋白

质的四级结构

,

SDS

是一种阴离子表面活性剂即去污剂

,

它可以断开分子内和分子

间的氢键

,

破坏蛋白质分子的二级及三级结构

,

并与蛋白质的疏水部分相结合

,

破

坏其折叠结构

,

电泳样品假如样品缓冲液后

,

要在沸水中煮

3-5

分钟使

SDS

与蛋白

质充分结合形成

SDS-

蛋白质复合物

,SDS-

蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存

在时

,

蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化

,

蛋白质也完全变性和解聚

,

并形

成榛状结构

,

稳定的存在于均一的溶液中

,SDS

与蛋白质结合后使

SDS-

蛋白质复

合物上带有大量的负电荷

,

平均每两个氨基酸残基结合一个

SDS

分子

,

这时各种

蛋白质分子本身的电荷完全被

SDS

掩盖

,

远远超过其原来所带的电荷

,

从而使蛋

白质原来所带的电荷可以忽略不计

,

消除了不同分子之间原有的电荷差别

,

其电泳

迁移率主要取决于亚基分子质量的大小

,

这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基

.

样品处理液中通常加入溴酚蓝染料

,

溴酚蓝指示剂是一个较小的分子

,

可以自由

通过凝胶孔径

,

所以它显示着电泳的前沿位置

,

当指示剂到达凝胶底部时

,

即可停

止电泳

.

另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度

,

使加样时样品溶

液可以沉入样品加样槽底部

.

重要参数

①聚丙烯酰胺凝胶

(PAG)

制备原则

:

由于孔径的大小取决于单体和双体丙烯酰胺

在凝胶中的总浓度

(T)

以及

双体占总浓度的百分含量即交联度

(C)

决定的

,

因而制

胶之前必须首先知道这两个参数

.

一般可以由下述公式计算

:

T%=(a+b)/m*100%;

和

C%=a/(a+b)*100%

其中

:a=

双体

(bis)

的重量

;b=

单体

(arc)

的重量

;m=

溶液的体积

(ml)

②当分析一个未知样品时

,

常常先用

7.5%

的标准凝胶制成

4-10

的梯度凝胶进行

试验

,

以便选择理想的胶浓度

.

如果蛋白质的分子量已知

,

可参考下表选择所需凝

胶浓度

:

蛋白质分子量范围

(Da)

适宜的凝胶浓度

(%)

10420-30