一材料与设备

1）RNA消化液：每100ml包含40ml4mol/L硫氰酸胍，3mllmol/LTris-HC(PH7.6),2.4ml30%N-十二烷基肌氨酸钠，DEPC处理水（54.6ml)

2）β-巯基乙醇：用前必须将其加入到消化液中，每l00ul溶液加0.28ul4℃储存

3）蛋白酶K（20mg/ml):溶于DEPC水（50%)和甘油（50%)，储存于一20℃

4）水平衡苯酚:对光和氧化作用非常敏感，为了减少酚的氧化速率，在储存液中加入8-羟喹啉（0.1%）酚/水使用液可放于深色瓶中4℃保存，储存液必须放于一20°C保存，有效期2年

5）氯仿

6）糖原：1.0mg/ml溶于水，分装储存一20℃

7）TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl(PH8.0),1mmol/LEDTA(PH8.0)

8）异丙醇

9）乙醇：无水乙醇，95%乙醇，75%乙醇

10）DEPC水


二操作方法

1.石蜡切片

用标准切片机切片6-8um厚，每个标本无须换刀，因为在每次切片中石蜡本身便可清洁刀刃。在切完每个标本后用二甲苯去除刀刃残佘的石蜡，把切片放在1.5ml管中,为更便于处理切片，最好使用卷起的切片切片前将石蜡块放人冰箱降低温度，可获得这种切片

2.脱蜡

从组织中抽提第一步用有机溶剂如二甲苯脱蜡，然后必须用乙醇清洗以完全去除二甲苯，因为二甲苯在后续阶段会干扰蛋白酶。

1)每个1.5mlEppendorf管屮最多放入5张切片，片厚6〜8um，用lml二甲苯室温脱蜡5min,2次。高速离心lOmin，每次保留沉淀。此时应注意沉淀并未很紧密地黏附于管底，小心移去上清液，勿丢失组织碎片。

2)用1ml无水乙醇冼涤10min,用95%乙醇再洗一次,离心lOmin,保留沉淀。

3)将离心管敞口于37℃放置30min,以除去乙醇，使组织在空气中干燥。

3.蛋白消化

为获取纯化的RNA，必须除左组织蛋白，最佳方法是使用蛋白水解酶消化。

1)在每个千燥样本中加人1倍体积（100〜300ul依据组织切片的量）含β-巯基乙醇(0.28ul/100ul溶液）的消化液。

2)加蛋白酶K,最终浓度为6mg/ml

3)45℃孵育过夜。

4.RNA抽提

1)每管加人1倍体积的水饱和苯酚：氯仿，比例7:3

2)混合均匀，置于冰上15min12000g离心20min。

3)保留上层水相，将其移到另一管中。

5.RNA沉淀

用糖原为载体的异丙醇进行沉淀，从溶液中获得RNA沉淀。

1)水相中加5ul糖原(1mg/ml)和1倍体枳的异丙醇，置于-20℃，48h。要获得足量RNA的沉淀，必须在20℃放较长时间

2)12000g,4℃离心20mm。RNA沉淀并不像DNA沉淀那样可紧紧粘附于微最离心管的底部，因此要轻轻倒出。清液，注意不要丢失RNA沉淀

3)100ul75%乙醇洗涤沉淀,保存于-20℃