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2.1.8 从福尔马林固定、石蜡包埋的组织中提取RNA一从福尔马林固定、石蜡包埋的组织中提取RNA
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试剂、试剂盒 | RNA消化液β-巯基乙醇蛋白酶K(20mgml)水平衡苯酚氯仿糖原TE缓冲液异丙醇无水乙醇乙醇DEPC水 |
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实验步骤 | 1)RNA消化液:每100ml包含40ml4mol/L硫氰酸胍,3mllmol/LTris-HC(PH7.6),2.4ml30%N-十二烷基肌氨酸钠,DEPC处理水(54.6ml) 2)β-巯基乙醇:用前必须将其加入到消化液中,每l00ul溶液加0.28ul4℃储存 3)蛋白酶K(20mg/ml):溶于DEPC水(50%)和甘油(50%),储存于一20℃ 4)水平衡苯酚:对光和氧化作用非常敏感,为了减少酚的氧化速率,在储存液中加入8-羟喹啉(0.1%)酚/水使用液可放于深色瓶中4℃保存,储存液必须放于一20°C保存,有效期2年 5)氯仿 6)糖原:1.0mg/ml溶于水,分装储存一20℃ 7)TE缓冲液:10mmol/LTris-HCl(PH8.0),1mmol/LEDTA(PH8.0) 8)异丙醇 9)乙醇:无水乙醇,95%乙醇,75%乙醇 10)DEPC水 二操作方法 1.石蜡切片 用标准切片机切片6-8um厚,每个标本无须换刀,因为在每次切片中石蜡本身便可清洁刀刃。在切完每个标本后用二甲苯去除刀刃残佘的石蜡,把切片放在1.5ml管中,为更便于处理切片,最好使用卷起的切片切片前将石蜡块放人冰箱降低温度,可获得这种切片 2.脱蜡 从组织中抽提第一步用有机溶剂如二甲苯脱蜡,然后必须用乙醇清洗以完全去除二甲苯,因为二甲苯在后续阶段会干扰蛋白酶。 1)每个1.5mlEppendorf管屮最多放入5张切片,片厚6〜8um,用lml二甲苯室温脱蜡5min,2次。高速离心lOmin,每次保留沉淀。此时应注意沉淀并未很紧密地黏附于管底,小心移去上清液,勿丢失组织碎片。 2)用1ml无水乙醇冼涤10min,用95%乙醇再洗一次,离心lOmin,保留沉淀。 3)将离心管敞口于37℃放置30min,以除去乙醇,使组织在空气中干燥。 3.蛋白消化 为获取纯化的RNA,必须除左组织蛋白,最佳方法是使用蛋白水解酶消化。 1)在每个千燥样本中加人1倍体积(100〜300ul依据组织切片的量)含β-巯基乙醇(0.28ul/100ul溶液)的消化液。 2)加蛋白酶K,最终浓度为6mg/ml 3)45℃孵育过夜。 4.RNA抽提 1)每管加人1倍体积的水饱和苯酚:氯仿,比例7:3 2)混合均匀,置于冰上15min12000g离心20min。 3)保留上层水相,将其移到另一管中。 5.RNA沉淀 用糖原为载体的异丙醇进行沉淀,从溶液中获得RNA沉淀。 1)水相中加5ul糖原(1mg/ml)和1倍体枳的异丙醇,置于-20℃,48h。要获得足量RNA的沉淀,必须在20℃放较长时间 2)12000g,4℃离心20mm。RNA沉淀并不像DNA沉淀那样可紧紧粘附于微最离心管的底部,因此要轻轻倒出。清液,注意不要丢失RNA沉淀 3)100ul75%乙醇洗涤沉淀,保存于-20℃ |
注意事项 | 1)硫氰酸胍冇毒.应通风橱屮处理,在棕色瓶中保存,室温存放,有效期2月。 2)需要高浓度蛋白酶K. 3)必须去除蛋白酶K和蛋白水解残基以免干扰后续步骤。用酚:氯仿抽提RNA时.蛋白位于有机物和水层之间的界面中,而RNA则位于水相 4)用这种方法抽提的石蜡包坪组织中的RNA是高度降解的,碎片长度介于100〜200个碱基,因固定和石蜡包埋条件不同,不同标本降解程度也不同。 |