可能的原因 建   议 1、蛋白未转到膜上 转膜结束后，用总蛋白染色剂染胶来确定转膜效率。（注：总蛋白染色剂可能检测不到低量的抗原。） 确保转膜过程中胶与膜完全接触。 确保转印夹层排布正确 确保按照膜的制造商的使用说明润湿膜 确保转印部件在电印迹过程中未过热 使用正对照和/或分子量Marker 优化转印时间和电流 确保样品制备条件优于蛋白印迹，为破坏样品的抗原性。（注意：许多蛋白不能在还原状态下进行） 2、蛋白未完全结合到膜上 在转膜缓冲液中加入20%的甲醇促进结合。低分子量的抗原可能会穿过转印膜，需使用小孔径的膜进行。 3、抗体不足 增加抗体浓度。抗体与目标蛋白的亲和力可能很小 抗体可能失活，可用斑点印迹检测其活性。 4、抗体浓度太高 使用太多一抗或二抗可能导致信号迅速消失，呈现出很弱的信号。 5、抗原不足 加入更多的蛋白进行跑胶 抗原被封闭液掩蔽 试用不同的封闭液 优化封闭液中蛋白浓度 6、缓冲液中含有叠氮钠 叠氮钠是一种HRP的抑制剂，缓冲液不能使用叠氮钠作为防腐剂 7、曝光时间太短 延长胶片的曝光时间（注意：超感应化学发光底物会持续发光至少6个小时） 8、底物孵育时间太短 在使用超感应底物时需进行5分钟的底物孵育。 9、底物失活 超感应化学发光底物和超感应west膜室温状态下化学底物可保存至少12个月，超感应免疫膜化学发光底物可保存至少6个月 为衡量底物的活性，准备一个小量的工作液在一个暗室内，加入少量的HRP结合物，会观察到绿光。如果未检测到光，底物或HRP结合物均有可能失活 确保两底物无交叉污染两种底物试剂的污染可能导致活性下降 10、膜可以修复剥离重新用探针检测 在膜剥离过程中可能会有抗原损失或变性 优化剥离程序 如有必要可重新用探针检测 避免在同一张膜上重复进行探针检测 11、在膜上消解抗原 封闭底物可能含有蛋白水解酶活性（如明胶） 12、印迹膜保存时蛋白降解 准备一张新的印迹膜