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总糖含量的测定实验一苯酚硫酸法
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实验方法原理 | 苯酚-硫酸试剂可与游离的或寡糖、多糖中的己糖、糖醛酸(或甲苯衍生物)起显色反应,己糖在490nm处(戊糖及糖醛酸在480nm)有最大吸收,吸收值与糖含量呈线性关系。 |
---|---|
实验材料 | 葡萄糖 |
试剂、试剂盒 | 浓硫酸苯酚 |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 1.材料的处理:将0.5~1g所测的材料捣碎,用适量蒸馏水、玻璃碾磨器碾磨并分次抽提,混合液离心得抽提液即样品液。 2.标准曲线制作:取50μg/ml的己糖标准溶液0ml,0.1ml,0.2ml,0.3ml,0.4ml,0.5ml于试管中,用水补足到0.5ml,加0.3ml5%酚溶液,混匀后快速加入1.8ml浓硫酸,振荡混匀,室温放置20 min即可出现橙黄色,以第一管调零点,可于490nm处比色测定读OD值。以糖含量为横坐标,相应的OD值为纵坐标,绘制标准曲线。 3.样品含量测定:取0.5ml内含2~25μg糖量,同样加入0.3ml5%酚溶液,混匀后立刻沿管壁加入浓硫酸1.8 ml,振荡混匀,达室温后,可测490nm处的OD值,从标准曲线上查相应糖含量。 |
注意事项 | 1.几种己糖测定方法中所使用的显色剂,如蒽酮、间苯二酚等,都需要沸水浴加热,而本法不需要,且蛋白质的存在对本法的显色反应影响不大,故也可用于糖蛋白中的己糖测定。除此之外,还可用于己糖甲基化衍生物和6-脱氧核糖、戊糖的测定。 2.本法的热量来自浓硫酸与水的混合,因此加浓硫酸时反应快,且立即混匀,试管应大一些,以免烫手。 |