2016-12-15求助……western条带不均匀…

展开引用icy_fan 实验室只有我在做WB

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这个是上次跑的目的的条带，都是这样成块状的，而且也是条带不均匀…跑了两三次了还是这样求指导…

又做了一次内参还是这样……

可能原因：1，胶凝得不好2，胶在转膜夹中被挤压变形3，电泳电压太高，胶发热变形

展开引用China13113可能原因：1，胶凝得不好2，胶在转膜夹中被挤压变形3，电泳电压太高，胶发热变形......谢谢解答！请问胶凝得不好需要怎么调整呢…电泳电压是100V不过实验室电压不稳经常调到A，像图片这样，电泳完了电泳液是热的。另外条带跑成这样会和样本蛋白不好有关吗？

第一次跑的时候反而还好一些，越往后条带越不好了，这是第一次的内参条带

胶的问题可以在论坛里搜下，有很多很好的分享。是否用的使回收的抗体，可以新配再试。样本不好也会影响条带，重新提蛋白。或用别人跑得好的样本试试，找原因。

展开引用China13113胶的问题可以在论坛里搜下，有很多很好的分享。是否用的使回收的抗体，可以新配再试。样本不好也会影响条带，重新提蛋白。或用别人跑得好的样本试试，找原因。......抗体都是用的新配的蛋白在煮沸之前在常温搁置了半个小时的样子，不知道有没有影响诶

icy_fan抗体都是用的新配的蛋白在煮沸之前在常温搁置了半个小时的样子，不知道有没有影响诶PMSF的有效时间大概就一个小时，还是尽快处理，减少酶对蛋白的影响。

China13113PMSF的有效时间大概就一个小时，还是尽快处理，减少酶对蛋白的影响。嗯嗯！谢谢！今天又重新提取了蛋白，但是到后面发现移液枪会抽出泡沫来然后污染到下一管蛋白…这个泡对于100μL的总含量50μg的蛋白影响大么…

不客气！有泡沫是难免的，只是多少的而已，一般没什么影响。100μL的总含量50μg的蛋白？提的组织还是细胞的蛋白，浓度偏低。一般少的都有2-3ug/ul以上。

展开引用China13113不客气！有泡沫是难免的，只是多少的而已，一般没什么影响。100μL的总含量50μg的蛋白？提的组织还是细胞的蛋白，浓度偏低。一般少的都有2-3ug/ul以上。......感觉各种突发问题…是我稀释到2μg/μl的，上样量是不是最好大于5μl呢…不然我就白稀释了…

展开引用China13113不客气！有泡沫是难免的，只是多少的而已，一般没什么影响。100μL的总含量50μg的蛋白？提的组织还是细胞的蛋白，浓度偏低。一般少的都有2-3ug/ul以上。......提的组织的！提出来大概在10μg/μl的样子

建议在4度冰箱跑胶，可以解决发热问题

钊lucy建议在4度冰箱跑胶，可以解决发热问题没有这个冰箱跑胶的设备呀

icy_fan没有这个冰箱跑胶的设备呀那就找个大冰盒，放进去，加冰跑。这总有了吧

钊lucy那就找个大冰盒，放进去，加冰跑。这总有了吧有！还好实验室有制冰机～都不知道条带这样半截半截是咋回事…从头开始排查…

icy_fan感觉各种突发问题…是我稀释到2μg/μl的，上样量是不是最好大于5μl呢…不然我就白稀释了…一般上样量在5-15ul，体积太小或大都不好。总蛋白可以20-30ug.

China13113一般上样量在5-15ul，体积太小或大都不好。总蛋白可以20-30ug.内参我都上的10μg…看来稀释得有点过了呀

展开引用icy_fan六个样本上样量一样的，内参条带结果成这样了…求告知是什么原因呀......想咨询一下内参是必须要跑的吗

icy_fan内参我都上的10μg…看来稀释得有点过了呀可以上多点。毕竟目的蛋白的含量一般都比内参蛋白要低。

China13113可以上多点。毕竟目的蛋白的含量一般都比内参蛋白要低。嗯嗯之前的条带都是跑成图上那样半截半截的，现在还不知道从哪里下手改

icy_fan嗯嗯之前的条带都是跑成图上那样半截半截的，现在还不知道从哪里下手改

China13113重新提蛋白，再做下，样本体积可多加点。积层胶如果短了不会出现你现在的情况。电泳电压别太高，可以把电泳液预冷，尽量别用回收的电泳液。已经重新提了蛋白啦，但是电泳的时候电压一直往下掉…用了稳压器还是这样，不知道为什么会这样…圣诞快乐啦！

以前做wb时在抗体孵育有气泡，或转膜未放好时都出现过类似楼主的情况。另外建议请做wb比较好的师兄师姐帮忙盯着下，看步骤中是否出了问题。

晨光微曦以前做wb时在抗体孵育有气泡，或转膜未放好时都出现过类似楼主的情况。另外建议请做wb比较好的师兄师姐帮忙盯着下，看步骤中是否出了问题。实验室只有我在做WB

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小学生专被坑想咨询一下内参是必须要跑的吗内参是必须要跑的呀

展开引用晨光微曦你用的是机器曝光还是压片曝光？机器若不调准可能会有实际是一致，但曝出来有差异的情况。或者蛋白定量是否不准这种情况可以打乱蛋白加样次序，把你中间条带浅的蛋白放到边上去曝光，看看是否还出现中间浅两边深的情况。......我用的机器曝光…这个同样的上样量同样的样品，两个不同的海绵材料做出来的也有差别…都可以看出来中间灰度小就是了…

wenshl2005国产的湿转槽转出来是这个样子。怀疑和夹板材料的结构强度有关。夹子是伯乐的，买了用两年多了吧…然后转的两个夹子，一个夹子里的海绵是天能的，另外一个夹子里的是伯乐那种像网子一样的黑色的棉加伯乐的厚滤纸，那个网子真的超大的

icy_fan已经重新提了蛋白啦，但是电泳的时候电压一直往下掉…用了稳压器还是这样，不知道为什么会这样…圣诞快乐啦！是否用了回收的电泳液？用新的吧。如果不是，电泳液有问题。看看配方，或其中的成分，或水哪里有问题。

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China13113上面的结果是伯乐的海绵垫，还是下面的？下面的是伯乐的海绵垫，电泳液是新配的，我回去找找配方

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