2021-08-13【方法经验】膜片钳

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您好我想请问一下检测钙通道电流时用的具体细胞外液和细胞内液

手头没现成的，pubmed上搜吧

基本要求：Rs<20mbm，封接时Rs变动小于20%，Rs/Rm<20%，最好在10%左右。记录mEPSC时要求Rs/Rm<10%（破膜效果越好，Rs电阻越小）。膜漏电流<100pA。中间神经元较小,Cm为80-100pF,Rm为200MΩ以上。诱发的AP约20次/分，而锥体神经元6-10次/分。各种离子通道的激活电位：快钠通道-40mv，低阈值钙-100mv，高阈值钙-20mv，钾-40mv以上至0mv以上。哺乳动物神经元可通透离子的平衡电位（37度）：钠+56mv钾-102m氯-76mv钙+125mv向上的是外向电流（电压钳膜式），是超极化反应。规定：内向电流：正离子入胞，电流向下（正离子进下来），是正电流，表示正离子从微电极尖端进入细胞内，引起胞膜去极化。膜漏电流，有时不正规地称为漏电流。指的是电容电流和电阻电流，是细胞膜的固有的电缆特性，是被动反应电流，区别于胞膜离子通道开放引起的电流改变，后者是活细胞的主动反应。膜电阻Rm：定义为电流经过胞膜时受到的阻力（此时可能有离子通道开放而电阻降低），但实际使用中以膜输入阻抗Rin的值代替Rm（因Rin更准确可靠稳定）。电极电阻，是玻璃微电极本身的电阻，为串联电阻的主要成份。其大小受玻璃微电极的开口大小及形状影响。膜电容Cm，细胞内液—膜脂双分子层—细胞外液构成的电容。Whole-cell模式下，Cm由整个细胞膜构成。电极电容，为快电容的主要成份。包括电极浸液部分（电极内液？）与浴液之间所形成的跨壁电容，电极非浸液部分与邻近地表形成的漂浮电容。快电容最大几个pF。实际上任何两导体之间都存在电容。注意Cfast是在封接好后才补。慢电容：电极尖端与地（或浴液）之间的电容。最大可达几十个pF。Cslow是破膜后才补，一般不补。但所记录的通道电流很快被激活，与膜电容充放电重叠，则须补偿Cslow串联电阻Rs：指除Rm外的其它电阻，包括电极电阻，破裂细胞膜碎片的膜电阻等。记录过程中，随着电极尖端碎膜增多，Rs增大，滤波器效能增强，致记录的电流信号的高频成分减少，电流基线变细。分析：Cm与Rs构成一个串联的RC电路，表现了电容特性，通高阻低，有滤波效应；对高频信号，电路中主要电阻在Rs上，如果Rs增大，电路中电阻增大，信号损失明显，而对低频信号，电路中电阻主要为Cm的电阻，Rs增大，对电路中总电阻影响小，即Rs的增大对低频信号影响小，低频信号损失不大。因此，串联电阻增大，滤除更多高频信号，电流基线变细。采样常规步骤：封接前低倍镜下摄片记录细胞位置；破膜后等15min使电极内液与细胞内液交换达稳态；加药前记1-2min的对照图；记录Rm,Cm,Rs；计算好药物达浴槽的时间；记药物反应图；撤药；ACSF洗脱10-15min；低倍镜下摄片确认细胞位置。I，Cm，Rm：记录到的电流I含两个成分，Im+Ileak，一般钳制在-70mv时，I<400pA，-60mv时，I<300pA。而Cm,Rm与细胞大小有关，二者相对应关系为150pF对应150MΩ，200pF对应100MΩ，100pF对应200MΩ。中间神经元较小80-100pF,Rm为200MΩ。尾电流一般是慢成分电流，如钙离子或钾离子中的慢通道成分。外向电流一般是钾离子。Latency：刺激后5ms左右的反应是单突触联系的反应。分辨突触前、后效应：突触后效应，只影响幅度，突触前效应，只影响频率。EPSC、IPSC：一般记录到的EPSC、IPSC是AP依赖的电流，而mEPSC、mIPSC是非AP依赖的电流一般细胞受到-300mv至+300mv电流可耐受，此范围之外的电流刺激较难耐受甚至死亡。50pA可诱发AP。电压钳切换至电流钳时不要直接切过去，中间过渡一下I=0，这样细胞受损会小一些。减少干扰：在不影响实验指标的情况下改变滤波设置可明显改变噪声大小。一般10KHz即够用，越小噪声越小，但可能丢失信息越多。patchmaster中的参数意义：RRm膜电阻;Rs串联电阻;Cslow即膜电容；Cslow*Rs=时间常数动作电位频率适应:是锥体神经元和中间神经元的区别之一。高频电流注入诱发AP，在锥体神经元中AP很快衰减，而IN不会。

谢谢楼主分享，对初学者十分有用！

1动作电位频率适应:是锥体神经元和中间神经元的区别之一。高频电流注入诱发AP，在锥体神经元中AP很快衰减，而IN不会。注意spinystellateneurons镜下外形近IN，但实际是兴奋性的神经元，电生理性质与锥体相近，也有AP的频率适应。mostFS（fire-spike)neurons(235/258incontrolcortexand147/169indysplasticcortex)werePVimmunoreactive.（Reducedchemicalandelectricalconnectionsoffast-spikinginterneuronsinexperimentalcorticaldysplasia）。还有个概念是刺激适应性（stimulusadaptation)，指的是频繁的刺激信息会导致神经元反应性下降，depress,而这点上，中间神经元较之锥体神经元降得更厉害。Uponrepetitivethalamicfiring,stimulusadaptationtakesplacewherethalamocorticalinputstobothPVandPCneuronsdepress.InputstoPVINsdepressmuchmorethanthosetoPCs（2016GABAergicInterneuronsintheNeocortex:FromCellularPropertiestoCircuits）规律？什么道理？是不是理解有误？锥体对可诱发AP的强刺激有明显适应性，而INs对频繁的弱刺激有明显的depress？INs是硬汉，受不得温柔？PCs只是书生，承不起重压？2一直以为受体只存于突触后膜，但是突触前膜也有受体，作用机制如何？下面是百度来的答案，继续收集完善：突触前膜受体相当于一个反馈机制的中间调节器，突触间隙递质多了，作用于突触前膜受体，会使释放量减少；突触间隙递质少了，作用于突触前膜受体，会使释放量增加。3去极化诱导的突触阻滞（depolarization-inducedsynapticinhibitionDSI）比如在CckBasketCells（属5HT3aR中的non-VIPINs的一种）在突触前膜表达CB1大麻素受体。激活前膜的大麻素受体，会抑制GABA释放，从而介导一种叫做“去极化诱导的突触阻滞DSI”，在此过程中，突触后的细胞因去极化而产生的内源性大麻素抑制了突触前细胞介导的阻滞效应。4INs的电联接成年动物的锥体细胞间并无电偶联，但INs间的电联接出现概率仍高，但主要出现在同种的INs间。如：100-150um范围内的PVFSCells密集联接，LTSSstINs之间也如此，但不同亚型INs间就没有这种联接（但也有矛盾的数据出现）。

很有用

展开引用chliang2006基本要求：Rs<20mbm，封接时Rs变动小于20%，Rs/Rm<20%，最好在10%左右。记录mEPSC时要求Rs/Rm<10%（破膜效果越好，Rs电阻越小）。膜漏电流<100pA。中间神经元较小,Cm为80-100pF,Rm为200MΩ以上。诱发的AP约20次/分，而锥体神经元6-10次/分。各种离子通道的激活电位：快钠通道-40mv，低阈值钙-100mv，高阈值钙-20mv，钾-40mv以上至0mv以上。哺乳动物神经元可通透离子的平衡电位（37度）：钠+56mv钾-102m氯-76mv钙+125mv向上的是外向电流（电压钳膜式），是超极化反应。规定：内向电流：正离子入胞，电流向下（正离子进下来），是正电流，表示正离子从微电极尖端进入细胞内，引起胞膜去极化。膜漏电流，有时不正规地称为漏电流。指的是电容电流和电阻电流，是细胞膜的固有的电缆特性，是被动反应电流，区别于胞膜离子通道开放引起的电流改变，后者是活细胞的主动反应。膜电阻Rm：定义为电流经过胞膜时受到的阻力（此时可能有离子通道开放而电阻降低），但实际使用中以膜输入阻抗Rin的值代替Rm（因Rin更准确可靠稳定）。电极电阻，是玻璃微电极本身的电阻，为串联电阻的主要成份。其大小受玻璃微电极的开口大小及形状影响。膜电容Cm，细胞内液—膜脂双分子层—细胞外液构成的电容。Whole-cell模式下，Cm由整个细胞膜构成。电极电容，为快电容的主要成份。包括电极浸液部分（电极内液？）与浴液之间所形成的跨壁电容，电极非浸液部分与邻近地表形成的漂浮电容。快电容最大几个pF。实际上任何两导体之间都存在电容。注意Cfast是在封接好后才补。慢电容：电极尖端与地（或浴液）之间的电容。最大可达几十个pF。Cslow是破膜后才补，一般不补。但所记录的通道电流很快被激活，与膜电容充放电重叠，则须补偿Cslow串联电阻Rs：指除Rm外的其它电阻，包括电极电阻，破裂细胞膜碎片的膜电阻等。记录过程中，随着电极尖端碎膜增多，Rs增大，滤波器效能增强，致记录的电流信号的高频成分减少，电流基线变细。分析：Cm与Rs构成一个串联的RC电路，表现了电容特性，通高阻低，有滤波效应；对高频信号，电路中主要电阻在Rs上，如果Rs增大，电路中电阻增大，信号损失明显，而对低频信号，电路中电阻主要为Cm的电阻，Rs增大，对电路中总电阻影响小，即Rs的增大对低频信号影响小，低频信号损失不大。因此，串联电阻增大，滤除更多高频信号，电流基线变细。采样常规步骤：封接前低倍镜下摄片记录细胞位置；破膜后等15min使电极内液与细胞内液交换达稳态；加药前记1-2min的对照图；记录Rm,Cm,Rs；计算好药物达浴槽的时间；记药物反应图；撤药；ACSF洗脱10-15min；低倍镜下摄片确认细胞位置。I，Cm，Rm：记录到的电流I含两个成分，Im+Ileak，一般钳制在-70mv时，I<400pA，-60mv时，I<300pA。而Cm,Rm与细胞大小有关，二者相对应关系为150pF对应150MΩ，200pF对应100MΩ，100pF对应200MΩ。中间神经元较小80-100pF,Rm为200MΩ。尾电流一般是慢成分电流，如钙离子或钾离子中的慢通道成分。外向电流一般是钾离子。Latency：刺激后5ms左右的反应是单突触联系的反应。分辨突触前、后效应：突触后效应，只影响幅度，突触前效应，只影响频率。EPSC、IPSC：一般记录到的EPSC、IPSC是AP依赖的电流，而mEPSC、mIPSC是非AP依赖的电流一般细胞受到-300mv至+300mv电流可耐受，此范围之外的电流刺激较难耐受甚至死亡。50pA可诱发AP。......mark总结的很好

chliang2006做了个膜片钳的PPT，其中部分内容转自网上，部分内容偷自老师，见谅，传上来供大家拍砖，另外，恳请版主能赏给一分，无分寸步难行啊好东西，

谢谢楼主分享，学习了

来自2017年的感谢！

感谢楼主