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:~)以前都是使用Amersham的NylonN+膜碱转法做southern,结果一直很好。后来这个型号的膜升级了,说明书上说不能用碱转,原来的版本又停产了,我就打算拿新膜重新实验一下。
共杂了5张膜,其中两张是升级版的NylonN+,另外两张是Osmonics公司的MAGNA:NylonTransferMembrane,还有一张是之前碱转法杂交过的,结果很好的膜,拿来重复杂交用做阳性对照。
我们按照说明书上用10×SSC转24h,UV焦联800J,洗膜,预杂交6h后用标记了同位素的探针杂交过夜,洗膜40min,用盖格计数器扫描五张膜上计数都很明显,而且膜上不同的部位信号强度不同,当时估计肯定是杂上了,心里挺高兴的。
可是压磷屏24hour后,扫描结果除了五张白白的膜什么也看不到。
现在可以肯定的是:磷屏、同位素和标记试剂盒都没问题(因为用做Northern结果很好)。
这样一来就提出以下几个疑问:
1,如果是转膜的问题,为什么阳性对照那张膜也杂不出来呢?
2,如果是标记探针模板的问题,为什么我们的Marker(λDNA)也杂不出来呢?λDNA做模板应该不会出问题吧。
3,如果是扫描系统的问题为什么别人的都能扫出结果?
4,如果是磷屏坏了,为什么还能看到五张白白的膜,而不是漆黑一片?
5,如果没有杂交上,为什么用计数器扫描时计数都很明显,而且膜上不同的部位信号强度也不同?
6,如果这两种膜不能使用同位素,为什么原来用同位素杂的很好的阳性对照也没有结果呢?
做之前已经仔细的阅读了两种膜的说明书,加之以前的经验,本来感觉是十拿九稳的事。再者说NylonN+和MAGNA:NylonTransferMembrane这两种膜是不同公司生产的,性质上有一定差别,按道理两种膜都杂不出来的可能行应该很小才对。感觉好像就在压磷屏之后可能出了什么问题,明明是有信号的为什么杂不出来呢??
希望有经验的朋友帮助分析一下,发表一下意见,不胜感激!
共杂了5张膜,其中两张是升级版的NylonN+,另外两张是Osmonics公司的MAGNA:NylonTransferMembrane,还有一张是之前碱转法杂交过的,结果很好的膜,拿来重复杂交用做阳性对照。
我们按照说明书上用10×SSC转24h,UV焦联800J,洗膜,预杂交6h后用标记了同位素的探针杂交过夜,洗膜40min,用盖格计数器扫描五张膜上计数都很明显,而且膜上不同的部位信号强度不同,当时估计肯定是杂上了,心里挺高兴的。
可是压磷屏24hour后,扫描结果除了五张白白的膜什么也看不到。
现在可以肯定的是:磷屏、同位素和标记试剂盒都没问题(因为用做Northern结果很好)。
这样一来就提出以下几个疑问:
1,如果是转膜的问题,为什么阳性对照那张膜也杂不出来呢?
2,如果是标记探针模板的问题,为什么我们的Marker(λDNA)也杂不出来呢?λDNA做模板应该不会出问题吧。
3,如果是扫描系统的问题为什么别人的都能扫出结果?
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做之前已经仔细的阅读了两种膜的说明书,加之以前的经验,本来感觉是十拿九稳的事。再者说NylonN+和MAGNA:NylonTransferMembrane这两种膜是不同公司生产的,性质上有一定差别,按道理两种膜都杂不出来的可能行应该很小才对。感觉好像就在压磷屏之后可能出了什么问题,明明是有信号的为什么杂不出来呢??
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