4小时⁵¹Cr释放法检测CMC活性

1）用⁵¹Cr铬酸钠标记靶细胞

短期标记法

1．用RPMI-1640培养液洗涤10⁷靶细胞，去上清液。用0.5ml不含碳酸氢钠的完全培养液悬浮细胞。加入100μCi（3.7MBq）⁵¹Cr铬酸钠，37℃水浴中标记1小时，每5～10分钟摇晃一次，混匀细胞。

2．如上用RPMI-1640培养液洗涤细胞3次，每次400×g10分钟。用50mlRPMI-1640培养液悬浮细胞，置37℃水浴30分钟，以减少非特异的自然释放。

3．离心200×g10分钟，去上清液。小心用RPMI-1640培养液悬浮细胞，尽量减少振荡引起的细胞损伤以降低靶细胞的自然释放率，将细胞浓度调整为0.5×10⁵或1×10⁵/ml备用。

2）4小时⁵¹Cr释放实验

1．在96孔圆底细胞培养板中加入⁵¹Cr标记的靶细胞，每孔加100μl。

2．向各孔加100μl效应细胞，效应细胞与靶细胞的比例（效靶比，E：T）根据要求而定，通常为5：1～20：1。阴性对照孔（自然释放）不加效应细胞只加100μl完全培养液，阳性对照孔（最大释放）中加100μl1％NP40（或2％SDS，1mol/L盐酸）。每个实验置三个复孔。

3．稍稍离心（100×g3分钟）后，置37℃5％CO₂的二氧化碳培养箱中培养4小时。

4．离心培养板200×g10分钟，每孔吸出100μl上清液置一次性使用的检测管中，在γ－计数仪上（或液闪计数仪上）测定上清液中的每分钟放射性活性（cpm值）。

3）特异性杀伤活性的计算

1．用细胞毒性百分比表示：细胞毒性（％）＝[（实验组cpm－自然释放组cpm）/（最大释放组cpm－自然释放组cpm）]×100％

2．用溶解单位（lyticunit，LU）表示：一个LU是指能溶解一定数量靶细胞的效应细胞数。通常将能溶解30％靶细胞的效应细胞数定位一个LU。结果以10⁶个效应细胞所具有的LU数表示：LU₃₀/10⁶细胞＝10⁶/[（E：T₃₀）×（每孔靶细胞数）]E：T₃₀是该效靶比时效应细胞能杀伤30％靶细胞