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细胞介导细胞毒作用检测法7:单细胞CMC试验
单细胞 CMC 试验
1. 用细胞培养液等量混合效应细胞和靶细胞, 30 ℃水浴 10 分钟。室温中 250 × g 离心 5 分钟,去上清液。同量靶细胞不加效应细胞同样处理作为对照。
2. 用少量细胞培养液轻轻悬浮细胞,吸管上下吹打 5 ~ 6 次。这一分散细胞的步骤关系到试验的准确性和重复性,应当设法保持技术的一致性。取少许细胞悬液,稀释后直接在显微镜下计数效应细胞和靶细胞的结合率,即平均每 100 各淋巴细胞中结合了靶细胞的效应细胞的数目。
3. 其余的细胞悬液与等量液态( 37 ℃)的 0.5 %低熔点琼脂糖混合均匀,铺在培养皿中,厚度≤ 2mm 。固化后小心加入适量细胞培养液覆盖琼脂糖层,置 37 ℃ 5 % CO2 的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养 1 ~ 4 小时。
4. 吸去培养液,加入适量 0.1 %台盼蓝覆盖琼脂糖层,室温染色 5 分钟。吸去染色液,加入适量 0.2 %甲醛覆盖琼脂糖层,室温固定 5 分钟。
5. 在显微镜下死亡细胞呈蓝色,计数靶细胞的死亡率。靶细胞的自发死亡率可以从经同样处理的靶细胞对照培养皿中测得。如区分效应细胞和靶细胞有困难,可以用双醋酸荧光素染色加以区分。镜下计数。
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